瓜蔞提取物的化學指紋特征及5種成分的定量分析

鄒純才，呂文雅，鄢海燕，洪國君，王莉麗

瓜蔞為葫蘆科植物栝樓（Trichosanthes kirilowiiMaxim.）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthorniiHarms.）的成熟陰干果實［1］，其皮稱為瓜蔞皮，子稱為瓜蔞子.由于瓜蔞不易陰干，有關文獻以瓜蔞皮：瓜蔞子（35：65）用于胸痹心痛等疾病的治療［2］.本研究在對瓜蔞提取溶劑、瓜蔞皮與瓜蔞子配伍比例考察的基礎上［3，4］，制備瓜蔞提取物，可為開發現代新劑型如滴丸、微丸奠定基礎［5，6］.本實驗對瓜蔞提取物的化學指紋圖譜及尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷進行定量分析，以期為瓜蔞提取物的質量控制提供理論依據.

1 實驗儀器及材料

1.1 實驗儀器

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津公司），FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司），DZF-6030A型真空干燥箱（上海恒一科技有限公司）.

1.2 實驗材料

瓜蔞提取物（皖南醫學院藥物制劑及其質量控制課題組制備，批號：lwy170601～lwy170610）；尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷（國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為：20150417、20140928、20150707、20140522、20150526）；甲醇、乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純.

2 方法

2.1 溶液的制備

（1）對照品溶液的制備.取尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷對照品適量，精密稱定，置于10mL容量瓶中，以15%甲醇溶解并定容，制備濃度均為0.10mg·mL-1的混合對照品溶液，備用.

（2）瓜蔞提取物供試品溶液的制備.取不同批次瓜蔞提取物，精密稱定，以15%甲醇溶解并定容，制備濃度為0.5g/mL的瓜蔞提取物溶液，備用.

2.2 色譜條件

色譜柱為YMC-PackODS-A（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A為甲醇，流動相B為0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～25min，100%B；25～40min，98%B；40～90min，98%B→80%B；90～200min，80%B→80%B.柱溫為25℃，檢測器為DAD，檢測波長為254nm，流速為1.0mL·min-1，進樣量為10μL.

3 結果

3.1 瓜蔞提取物HPLC化學指紋特征

（1）10批瓜蔞提取物的指紋圖譜.瓜蔞提取物及對照品的色譜圖，見圖1.根據《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，設置1號樣品色譜圖為參照圖譜，經多點校正，Mark峰匹配，生成對照圖譜，得到共有峰的數目為44個.其中1、2、3、4、5號峰分別為尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷.

圖1 瓜蔞提取物（a）及對照品（b）HPLC色譜圖

圖2 10批瓜蔞提取物HPLC指紋圖譜

表1 10批瓜蔞提取物的相似度值（±s，n=10）

表1 10批瓜蔞提取物的相似度值（±s，n=10）

（2）指紋圖譜相似度的計算.計算10批瓜蔞提取物的指紋圖譜與共有模式的相似度.結果見圖2，表1.

3.2 瓜蔞提取物中5種成分的定量分析

（1）標準曲線的建立.精密吸取混合對照品溶液，稀釋2、4、8、16倍，按“2.2”項下色譜條件進樣.以對照品溶液的質量濃度 x（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積y為縱坐標進行線性回歸.結果見表2.

表2 5種成分的回歸方程

（2）方法學考察.

①精密度.取瓜蔞提取物（批號：lwy170601）適量，按“2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件，連續進樣5次.結果顯示，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷峰面積的RSD分別為0.1%、0.3%、0.3%、0.2%、0.3%，表明儀器精密度良好.

②穩定性.取瓜蔞提取物（批號：lwy170601）適量，按“2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件，分別在0h、6h、12h、18h、24h進行測定.結果顯示，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷峰面積的RSD分別為1.7%、2.5%、0.9%、1.5%、2.7%，表明樣品溶液在24h內穩定性良好.

③重復性.取瓜蔞提取物5份（批號：lwy170601～lwy170605），按“2.1（2）”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項色譜條件測定.結果顯示，尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷峰面積的RSD分別為3.2%、2.4%、3.9%、1.4%、3.2%，表明方法重復性良好.

④加樣回收率.取已知尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷含量的瓜蔞提取物（批號：lwy170601）供試品溶液9份，分為3組，每組3份，每組分別按尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷已知含量的80%、100%、120%精密加入對照品.按“2.2”項下色譜條件進樣測定.結果見表3、表4.

表3 加樣回收率試驗結果

表4 瓜蔞提取物中5種成分的定量分析結果（±s，n=10）

表4 瓜蔞提取物中5種成分的定量分析結果（±s，n=10）

尿嘧啶次黃嘌呤黃嘌呤腺苷鳥苷1.12±0.13 0.45±0.05 0.15±0.04 1.53±0.06 1.16±0.18

4 討論

本研究考察了SynergiTMHydro-RP（4.6mm×250mm，4μm）和 YMC-Pack ODS-A（250mm ×4.6mm，5μm.）色譜柱及甲醇（乙腈）-水、甲醇（乙腈）-0.1%磷酸水溶液及甲醇（乙腈）-0.1%磷酸-0.02%三乙胺水溶液等流動相對瓜蔞提取物中主要色譜峰分離效果的影響，結果以YMC-Pack ODS-A（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱及甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動相，瓜蔞提取物的分離效果可滿足分析要求.流動相的pH對瓜蔞提取物中核苷類成分的分離效果影響較大，應注意保持流動相pH值的穩定.

現有文獻對瓜蔞的化學成分和藥理作用研究較多，但尚未有較為統一的瓜蔞提取物制備方法及質量評價方法.本課題組制備的瓜蔞提取物為瓜蔞經水提醇沉后冷凍干燥制備而得.藥理學研究表明［7-8］，瓜蔞提取物保留了瓜蔞的藥效成分，具有較好的抗氧化活性和抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用，可用于制備瓜蔞滴丸、瓜蔞片等現代劑型.中藥指紋圖譜用于中藥的質量評價已被國內外廣泛認可.由實驗結果可知，10批瓜蔞提取物HPLC化學指紋特征相似度的平均值為0.98，s值為0.005，說明不同批次的瓜蔞提取物的化學指紋特征相似度較高，且精密度較好，瓜蔞提取物的質量較為穩定.可設定瓜蔞提取物的化學指紋特征相似度值不得低于0.95.

課題組前期研究結果表明，腺苷、鳥苷、尿嘧啶、次黃嘌呤等和瓜蔞抗凝血作用有著重要聯系［7］，為此，本實驗在建立瓜蔞提取物HPLC指紋圖譜的同時，對尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷等5種成分進行了定量分析，方法準確，可靠，可滿足瓜蔞提取物的質量控制要求.結合本實驗瓜蔞提取物的化學指紋特征及尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、腺苷、鳥苷等5種成分的定量分析，可進一步進行瓜蔞提取物藥效學及譜效關系研究.