四倍體艾納香植株誘導及其倍性鑒定

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(1. 北京中醫藥大學 中藥學院，北京102488；2. 北京師范大學良鄉附屬中學，北京102488；3. 北京林業大學 林學院，北京100083)

艾納香[Blumeabalsamifera(L.) DC.]為菊科多年生植物，其葉片和嫩枝是提取艾片(左旋龍腦)的原料[1]?，F代醫學研究表明，艾片有抗炎鎮痛、抗茵、抗病毒、保護心腦、雙向調節神經系統、提高其他藥物生物利用等作用[2]，并且其解熱持續作用及持續強度大于天然冰片及合成冰片[3]。新鮮或干燥地上部分也作藥用，具有溫中止瀉、活血解毒、祛風除濕功能[4]，在臨床上的應用極為廣泛。

目前，左旋龍腦的提取工藝較為成熟，但是其在艾納香葉片和嫩枝中的含量較低，范圍在0.015%～0.220%[5]，嚴重制約了艾納香產業升級，選育出高含量的優良品種是其產業開發的重點。另一方面，多倍體植物具有器官“巨大性”，并且其營養成分及內源物質含量含量增加[6]。因此，培育四倍體植物新品種是中藥材豐產優質的有效途徑之一，特別是對于以單體化合物提取的某些藥用植物而言意義重大。

前人對艾納香的化學組成及提取工藝研究較多，如王秋萍等建立HPLC-RID同時測定艾納香葉中左旋樟腦、左旋龍腦及異龍腦含量的方法[7]；吳麗芬等人研究出建立GC法測定艾納香油中β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯5個成分的含量[8]。本課題組以艾納香植株不同部位葉片和莖為材料，系統開展了總黃酮提取工藝優化方法研究，并確定了總黃酮含量測定的方法[9]。到目前為止，仍未見四倍體艾納香誘導及倍性鑒定的研究報道。本研究應用組織培養技術，采用秋水仙素誘導艾納香組培苗，產生變異體并對其進行倍性鑒定為研究內容，研究結果為艾納香新品種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年4月，艾納香一年生苗取自貴州羅甸，種植于北京中醫藥大學藥用植物園。2013年5月，取艾納香植株莖尖，經過75%乙醇30 s及0.1%升汞5 min消毒處理后，再用無菌水沖洗3次，在培養基MS+6-BA 1.0 %+NAA 1.5 %+蔗糖3% +瓊脂1%(pH5.8)上誘導并繼代培養。培養條件: 溫度(25±2) ℃，光照強度1 000～1 500 lx，光照時間14 h/d。繼代培養出的艾納香組培苗應用于本研究。

1.2 方法

觀察艾納香組培苗生長動態，確定組培苗分裂旺盛期范圍，繪制Logistic生長曲線。采用浸泡法和混合培養兩種方法進行多倍體誘導，每種方法均設置若干組處理時間和濃度梯度，研究不同秋水仙素濃度及處理時間對誘變率的影響。

1.2.1 Logistic生長曲線

選取(0.2±0.02) g的艾納香莖尖組織，在繼代培養基上進行培養，每天取出稱重，算出每天的增重量(g)，繪出Logistic生長曲線。

1.2.2 秋水仙素誘導

浸泡法：在組培苗繼代培養7 d后，挑選生長一致、莖節粗壯的組培苗，切成長1～2 cm的帶節莖段，放入經過高壓滅菌濃度為0.04%、0.06%、0.08%的秋水仙素溶液中，分別浸泡6 h、12 h、18 h，以無菌水浸泡為對照。將各處理后的材料用無菌水沖3遍后，培養在繼代培養基上，培養30 d后及下一代進行死亡率和變異率調查。

混合培養法：在組培苗繼代培養7 d后，選取生長一致、莖節粗壯的組培苗，切成長1～2 cm的帶節莖段，接種到分別添加0.015%、0.025%、0.035%秋水仙素溶液的繼代培養基上，分別經過5 d、7 d、9 d誘導培養后，將處理后的材料轉入不含秋水仙素的繼代培養基中繼續培養，培養30 d后及下一代進行死亡率和變異率調查。

1.2.3 形態學考察

以二倍體為參照，對變異植株從形態學進行考察，包括株高、葉長、葉寬、葉厚、莖粗等指標。

1.2.4 細胞學考察

上午9:00～10:00取全展葉片，用水保濕，用鑷子撕取葉片下表皮制片，用OLYMPUS 光學顯微鏡觀測氣孔及其保衛細胞的大小，并計算氣孔密度。

1.2.5 細胞中DNA含量檢測

采用流式細胞儀檢測分析細胞中DNA含量，參考周玉麗等[10]和張虹等[11]的方法。將艾納香嫩葉在盛有3 mL提取緩沖液的培養皿中剪碎，200目尼龍網過濾，1 000 r/min離心漂洗3次。制備的核懸液離心后棄去上層液體，加入2 mL染色緩沖液，暗處低溫下染色10 min，500目尼龍網過濾，濾液用標準試管收集，隨即上機測定。提取緩沖液成分：15 mol/L Tris-HCl (pH 7.5)，80 mol/L KCl，20 mol/L NaCl，20 mol/L EDTA-Na2，15 mol/L 巰基乙醇，0.05%的 TritionX-100。染色緩沖液為提取緩沖液內加入20 mg/L RNA酶A和20 mg/L碘化丙啶。

2 結果與分析

2.1 Logistic生長曲線

艾納香組培苗Logistic生長曲線如圖1所示。圖1表明，在接種第7 d時增重量最大，此時為植株細胞分裂旺盛期，故選擇接種7 d左右的組培苗作為秋水仙素誘導的材料。

圖1 艾納香組培苗Logistic生長曲線

2.2 不同秋水仙素處理方法對艾納香組培苗變異率的影響

以形態學和氣孔變異顯著作為變異的指標，考察秋水仙素浸泡法和混合培養法對艾納香組培苗變異率的影響，結果如表1和表2所示。表1表明，在浸泡法處理中，秋水仙素濃度為0.06%、時間為12 h組合時，艾納香組培苗的變異率最高，達到36.7%，以及子二代變異率也最高(63.3%)。表2表明，在混合培養法處理中，秋水仙素濃度為0.025%、時間為9 d組合時，艾納香組培苗的變異率最高，達到65%，以及子二代變異率也較高(74.4%)。本研究結果表明，浸泡法和混合培養法均能有效的誘導艾納香植株發生變異，以混合培養法更適合艾納香植株誘變，其秋水仙素濃度為0.025%并處理7～9 d為宜。

表1 秋水仙素浸泡法對艾納香組培苗變異率的影響

表2 秋水仙素混合培養法對艾納香組培苗變異率的影響

2.3 形態學考察

與對照相比，經過秋水仙素處理的艾納香變異植株的生長較為緩慢，株高較二倍體矮小了40.5%，而葉長、葉寬、葉厚及莖基部粗度較二倍體，分別顯著或極顯著增加了70.8%、96.5%、86.1%、53.8%(表3和圖2)。

表3 二倍體和四倍體艾納香組培苗的形態學比較

圖2 二倍體(左)四倍體(右)艾納香組培苗

2.4 細胞學考察

細胞學考察表明，四倍體艾納香植株葉片氣孔長徑、短徑以及保衛細胞長和寬，均較二倍體差異顯著或極顯著(表4)。表4表明，二倍體艾納香植株葉片氣孔為63.3 μm × 42.4 μm，而四倍體則為84.9 μm ×50.3 μm，極顯著或顯著增加34.1%和18.6%。同樣，四倍體艾納香植株葉片的保衛細胞的長和寬，較二倍體分別顯著增加49.6%和47.1%。四倍體艾納香植株葉片氣孔密度為6.0個/mm2，極顯著低于二倍體(6.0個/mm2)。

表4 二倍體和四倍體艾納香組培苗的氣孔及其保衛細胞比較

2.5 細胞DNA含量檢測

流式細胞儀檢驗結果如圖3所示。圖3表明，直方圖的縱坐標為細胞數(表示的是細胞的相對數)，橫坐標為道數(Channel No.)，實質上是所測的熒光的強度。二倍體植株僅在相對熒光強度值為256的位置上出現1個單峰(圖3左)，而四倍體植株在約在512的位置上出現1個單峰(圖3右)，后者為前者的 2 倍，這表明四倍體植株細胞中的DNA 含量也相應增加了一倍，表明四倍體細胞中DNA含量已倍增，說明秋水仙素誘導四倍體艾納香植株獲得了成功。

圖3 二倍體(左)和四倍體(右)艾納香組培苗葉片細胞中DNA含量

3 討 論

艾納香組培苗進行Logistic生長曲線表明，組培苗細胞的旺盛分裂期約在繼代培養第6～8 d，故在此期誘導能夠提高誘變成功率，這是本研究后續誘變成功的關鍵。

四倍體誘導率因秋水仙素濃度和處理時間不同而差異顯著。在本研究中，混合培養法在 0.015%～0.025%濃度范圍內，均表現出多倍體誘導率隨處理時間的增加而升高，但隨著處理時間延長，生長點都會受到嚴重傷害，組培苗的存活率降低；當濃度大于0.025%時，多倍體誘導率隨處理時間的增加而降低且死亡率顯著升高。在浸泡法中，秋水仙素的濃度變化對植株影響不如混培法明顯，但是處理時間對植株的死亡率影響也很大，并且其誘變率明顯低于混合培養法。本研究認為，與浸泡法相比，混合培養法更適合四倍體艾納香誘導。

秋水仙素誘導的變異株表現為葉色變綠，葉片變大、變厚，莖段變粗等。同時，其氣孔大小及密度均與二倍體有顯著差異，這與相關研究報道相一致[12]。因此，根據形態學及細胞學上的顯著差異進行多倍體初步篩選，再結合細胞中DNA含量及染色體數目檢測是確定其倍性的有效方法。

本研究建立了誘導同源四倍體艾納香的方法，通過繼代培養獲得了更多的四倍體無菌苗，現正在進行煉苗移栽，下一步進行田間觀察與測試，期望篩選出藥用成分含量高、豐產且抗逆性好的優良品種。