南極磷蝦油中砷甜菜堿在大鼠體內的代謝*

邱阿敏 劉小芳 唐一新 王曉濱 張輝珍 冷凱良

(1.農業農村部極地漁業開發重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071；2.青島大學公共衛生學院 青島 266021；3.青島市食品藥品檢驗研究院 青島 266071)

南極磷蝦(Euphausia superba)是一種生活在南極海域的小型海洋浮游甲殼類動物，現已成為世界遠洋捕撈業最重要的漁業資源(劉勤等, 2014、2015)。南極磷蝦油以南極磷蝦為原料經提取精制而得，因其富含ω-3 (EPA、DHA)系列多不飽和脂肪酸、磷脂以及蝦青素等功能脂類(Luet al, 2014； 劉建君等, 2014；聶玉晨等, 2016)，具有調節血脂、抗氧化、改善腦細胞功能等多種生理活性(Heet al, 2013； Wanget al,2011； Zhouet al, 2016)而受到廣泛關注。2013年我國衛生計生委第16號公告已批準南極磷蝦油為新食品原料，但由于南極磷蝦油中具有較高的總砷含量，使人們對其食用安全性產生一定疑慮，同時也限制了其在食品、功能食品和醫藥制品領域的應用推廣。

受原料及加工工藝影響，南極磷蝦油中總砷含量約為2.5～8.0 mg/kg，研究表明，其中主要砷形態是無毒的砷甜菜堿，含量為87.9%，而毒性較高的AsⅢ及AsⅤ僅約占南極磷蝦油中總砷含量的0.27% (王松等,2016)。本研究以南極磷蝦油中砷的主要形態—砷甜菜堿為重點研究對象，觀察灌胃添加高劑量砷甜菜堿的磷蝦油之后，大鼠臟器中總砷的吸收、蓄積、排泄及長期灌胃后的蓄積情況，為科學解釋南極磷蝦油中砷的毒性提供數據支持，同時也為南極磷蝦油在食品、功能食品和醫藥制品領域的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

砷甜菜堿：含量≥95%，購于日本Wako公司，貨號：321-34911

南極磷蝦油：紅棕色透明油狀，貯存于干燥、密封處，總砷含量為3.92 mg/kg

大豆油：金龍魚大豆油，嘉里糧油(天津)有限公司，總砷含量為0.037 mg/kg

1.2 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購于青島市實驗動物和動物實驗中心，實驗動物生產許可證號為SCXK(魯)20140001。飼養環境：溫度20～25℃，濕度40%～70%，基礎飼料喂養，自由飲食、飲水。

1.3 主要試劑與儀器

砷標準品：1000 μg/ml，GBW08611-15031(國家標準物質中心) 7500CX型電感耦合等離子體質譜儀(ICP-MS，美國Agilent公司)，MARS EXPRESS微波消解儀(美國CEM公司)，BSA 224S-CW型分析天平(德國 SartoriUS公司)，Milli-Q 超純水系統(美國Millipore 公司)。

1.4 方法

1.4.1 24 h吸收代謝實驗 SPF級雄性Wistar大鼠54只，隨機分為3組：大豆油對照組(對照組)、磷蝦油組、添加100 mg/kg砷甜菜堿的磷蝦油組(砷甜菜堿磷蝦油組)，每組18只。實驗前禁食不禁水12 h，灌胃劑量2.625 g油/kg·bw，于灌胃后1、2、4、6、12、24 h經戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血處死大鼠，收集血漿，剝離肝臟、腎臟、脾臟，收集12 h及24 h尿液。血漿、臟器和尿液均貯存于-80℃備用。

1.4.2 7 d、30 d連續灌胃實驗 SPF級雄性Wistar大鼠45只，隨機將動物分為3組：對照組、磷蝦油組、砷甜菜堿磷蝦油組，每組5只。連續灌胃7 d，實驗前禁食不禁水12 h，灌胃劑量2.625 g油/kg·bw，于末次灌胃后24 h，經戊巴比妥鈉麻醉，剝離肝臟、腎臟。相同的分組，每組10只，連續灌胃同等劑量的油脂30 d，末次灌胃后24 h，經戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血處死大鼠，剝離肝臟、腎臟，貯存于-80℃備用。

1.5 總砷的測定

血漿、臟器及尿液中總砷含量檢測分析按GB5009.11-2014標準規定執行。

1.6 數據處理

2 結果

南極磷蝦油具有相對較高的總砷含量，但其所含的砷化合物絕大部分為砷甜菜堿，約占總砷含量的87.9% (王松等, 2016)。所以本研究采用總砷含量表征砷甜菜堿的代謝。

2.1 南極磷蝦油中砷甜菜堿24 h消化吸收代謝

2.1.1 不同時間點大鼠血漿中總砷含量變化 不同實驗組大鼠血漿中總砷含量變化情況如圖1所示。灌胃后，磷蝦油組和砷甜菜堿磷蝦油組血漿中總砷在1 h時含量最高，隨時間延長而降低。各時間節點下，砷甜菜堿磷蝦油組總砷含量高于對照組，但隨著代謝的進行，大鼠血漿中總砷含量逐漸降低，24 h降至最高值的30%以下。磷蝦油組較對照組血漿總砷含量略有升高，但在24 h之內即降低至正常水平。

圖1 不同時間節點大鼠血漿中總砷含量Fig.1 Total arsenic content in rat plasma at different time points

2.1.2 不同時間點大鼠肝臟中總砷含量變化 不同實驗組大鼠肝臟中總砷含量變化情況見圖2。灌胃后，砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟中總砷含量隨時間延長而增加，于6 h達到最高，最高含量為6.24 mg/kg，而后逐漸降低，24 h含量降至最高值25%以下，趨近于初始水平。與對照組相比，磷蝦油組大鼠肝臟總砷含量除1 h時間節點外，均無顯著差異，且無隨時間變化的趨勢。

圖2 不同時間節點大鼠肝臟總砷含量Fig.2 Total arsenic content in liver of rat at different time

2.1.3 不同時間點大鼠腎臟中總砷含量變化 不同實驗組大鼠腎臟中總砷含量變化情況見圖3。灌胃后，砷甜菜堿磷蝦油組大鼠腎臟中總砷含量隨時間延長而增加，于6 h達到最高，最高含量為2.97 mg/kg，而后逐漸降低，24 h含量降至最高值16%以下，恢復至初始水平。磷蝦油組相比于對照組，總砷含量沒有顯著性差異，且無隨時間變化的趨勢。

2.1.4 大鼠尿液中總砷含量變化 不同實驗組大鼠灌胃12 h和24 h后尿液中總砷含量如表1所示。砷甜菜堿磷蝦油組和磷蝦油組大鼠12 h和24 h尿液中總砷含量明顯高于對照組(P＜0.05)。根據灌胃劑量2.625 g磷蝦油/kg·bw折算成砷甜菜堿含量，砷甜菜堿磷蝦油組每只大鼠平均分別給予0.0525 mg砷甜菜堿，磷蝦油組每只大鼠平均分別給予 0.00525 mg砷甜菜堿。根據12 h和24 h尿液量及總砷含量，計算得出砷甜菜堿的尿液排泄率。在 24 h之內，磷蝦油組中的砷 85%隨尿液排出體外；砷甜菜堿磷蝦油組12 h尿液排泄率為36%，24 h尿液排泄率為80%。

圖3 不同時間的大鼠腎臟中總砷含量Fig.3 Total arsenic content in kidney of rat at different time

圖4 不同時間節點的大鼠脾臟中的總砷含量Fig.4 Total arsenic content in spleen of rat at different time

表1 大鼠尿液總砷含量±s, n=5)Tab.1 Total arsenic contents in the urine of the experimental rats ±s, n=5)

表1 大鼠尿液總砷含量±s, n=5)Tab.1 Total arsenic contents in the urine of the experimental rats ±s, n=5)

注：不同字母標識代表各時間節點下不同實驗組間具有顯著差異(P＜0.05)；— 表示無統計Note：Different letters represent significant differences between different experimental groups at each time point (P＜0.05)；—, no statistical calculation

組別Groups 12 h 24 h 12 h 24 h總砷含量 Total As (mg/kg) 尿液排泄率Urine excretion rate (%)對照組Control 0.073±0.007a 0.075±0.009a — —磷蝦油組 Krill oil group 0.418±0.079b 0.478±0.058b 42 85砷甜菜堿磷蝦油組Krill oil with arsenobetaine 3.756±0.486c 4.527±0.636c 36 80

2.1.5 不同時間點大鼠脾中總砷含量變化 不同實驗組大鼠脾中總砷含量變化情況如圖4所示。灌胃后，砷甜菜堿磷蝦油組脾中總砷含量隨時間延長而增高，于6 h達到最高，最高含量為1.23 mg/kg，而后逐漸降低，24 h含量降至最高值30%，趨近于初始水平。與對照組相比，磷蝦油組大鼠脾臟總砷含量除 2 h和24 h時間點外均無顯著差異，且無隨時間變化的趨勢。

2.2 南極磷蝦油中砷甜菜堿7 d、30 d連續喂養

連續灌胃7 d和30 d后，不同實驗組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量見表2。與對照組相比，連續灌胃7 d和30 d，磷蝦油組和砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量均無顯著變化(P＞0.05)，且二者間也無顯著差異(P＞0.05)。由此可見，隨著給予砷甜菜堿時間的延長，大鼠肝臟和腎臟中總砷含量并沒有隨之增加。以上實驗結果證明，磷蝦油中的砷甜菜堿在體內并不會產生蓄積作用。

表2 7 d、30 d喂養大鼠臟器中總砷含量(±s)Tab.2 Total arsenic contents in the organs of the experimental rats fed for 7 or 30 days (±s)

表2 7 d、30 d喂養大鼠臟器中總砷含量(±s)Tab.2 Total arsenic contents in the organs of the experimental rats fed for 7 or 30 days (±s)

*表示n=5, **表示 n=10*：n=5； **：n=10

肝臟 Liver (mg/kg) 腎臟 Spleen (mg/kg)組別Groups 7 d* 30 d** 7 d* 30 d**對照組 Control 1.161±0.209 1.002±0.300 1.019±0.111 1.072±0.381磷蝦油組 Krill oil group 1.270±0.123 1.378±0.308 1.183± 0.157 1.193±0.206砷甜菜堿磷蝦油組 Krill oil with arsenobetaine 1.891±0.390 1.731±0.158 1.565±0.277 1.439±0.445

3 討論

砷為有毒有害元素，砷毒性很大程度上取決于它的化學形態和氧化態(Nearinget al, 2014)，無機砷的毒性遠大于有機砷(Khairulet al, 2017； Sadeeet al,2015)，有機砷中砷甜菜堿和砷膽堿被認為是沒有毒性的。海產品中雖然砷含量較高，但多數是以有機砷的形態存在(Tayloret al, 2016)，且絕大部分為砷甜菜堿(Molinet al, 2015)。GB2762-2012《食品安全國家標準 食品中污染物限量》規定水產動物及其制品無機砷限量為 0.5 mg/kg，南極磷蝦油符合這一標準要求。GB16740-2014《食品安全國家標準 保健食品》規定液態產品總砷限量為 0.3 mg/kg。南極磷蝦油相對較高的總砷含量使其在保健品領域的應用受到了限制，因此，本研究針對攝食磷蝦油及其砷甜菜堿后大鼠血漿及臟器中總砷的代謝和蓄積情況進行了考察。

本研究為考察南極磷蝦油中砷的安全性，實驗設計時將中國營養學會膳食指南中規定的成人每日攝入 25 g油脂均更換為南極磷蝦油，考察最大限度攝入南極磷蝦油時，其所含的砷是否會帶來安全風險。根據成人和大鼠之間的劑量換算系數，計算得到大鼠灌胃劑量為2.625 g/kg·bw。肝臟是動物和人體最重要的代謝器官，并且砷代謝主要在肝臟中進行(劉洋等,2009)，而腎臟則是砷排泄的主要器官(李偉等, 2016)，脾是機體最重要的免疫和造血器官，研究證實砷暴露人群免疫功能受損(周勇等, 2010)。因此，本研究著重觀察了肝臟、腎臟和脾中砷甜菜堿的代謝情況。24 h消化吸收代謝實驗結果顯示，灌胃南極磷蝦油后，大鼠血漿中總砷含量在1 h達到最高，而后逐漸降低，24 h之內可降低至對照組水平。各時間節點下，磷蝦油組大鼠血漿、肝臟、腎臟中總砷含量較對照組均無顯著變化，脾中總砷含量較對照組略有升高，這與楊瑞瑛等(2005)的研究結果一致。砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟、腎臟和脾中總砷含量均隨時間的延長而增加，到6 h達到最高，之后逐漸降低，24 h后均下降至最高值的30%以下，提示大劑量的砷甜菜堿不會在肝、腎、脾等臟器中被蓄積。尿液中總砷分析結果顯示，南極磷蝦油中85%的砷會在24 h之內隨尿液排出體外，而其余小部分砷會隨膽汁等其他途徑排出體外(Doppet al, 2010)。Kaise等(1992)報道指出，砷甜菜堿具有低毒、不代謝的特點。檢測人攝食砷甜菜堿后的尿液發現，尿液中無機砷、一甲基砷酸和二甲基砷酸的濃度沒有出現升高現象，同樣證實了砷甜菜堿不會在人體內轉化為其他代謝產物(陳甫華等,1993)。

7 d和30 d連續灌胃實驗結果顯示，與對照組相比，磷蝦油組和砷甜菜堿磷蝦油組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量均無明顯差異，證明磷蝦油乃至超出正常磷蝦油中砷甜菜堿10倍的供試物并不會隨著攝入時間的增加而在臟器中產生積累。這與陳甫華等(1993)的研究結果一致。砷甜菜堿在人體沒有產生明顯毒副作用的靶器官，不在體內產生蓄積作用。另外，分別連續灌胃7 d和30 d，各實驗組大鼠肝臟和腎臟中總砷含量并未隨攝食時間的延長而出現顯著變化，表明短期和長期服用南極磷蝦油，其所含有的砷甜菜堿不會出現代謝蓄積現象。

綜上所述，攝食南極磷蝦油后，85%的砷會于24 h內隨尿液排出體外，而短期及長期攝食南極磷蝦油，體內也不會產生砷蓄積現象。本研究系統解釋了南極磷蝦油中所含的砷在大鼠體內的消化吸收代謝和蓄積情況，對于指導南極磷蝦油及其相關產品的科學消費和拓展應用具有重要意義。