急性低壓低氧環境下富氧干預對大鼠認知功能及海馬CA1區形態學的影響

阮俊勇，雷濤，董旭，翟明明，羅二平

1. 空軍軍醫大學 軍事生物醫學工程學系 軍隊衛生裝備教研室，陜西 西安 710032

2. 海軍青島第一療養院 器材科，山東 青島 266071

引言

醫學上的高原是指能引起明顯生物學效應的海拔3000 m以上的廣泛地區，是高原病的多發地區[1]。根據波義耳定律可知，氣體體積與壓強成反比，隨著海拔高度的增加，壓強會降低，空氣體積會變大，而空氣中氧氣濃度始終保持不變 [20.9% (V/V)]，所以隨著海拔高度的增加，單位體積空氣中氧的含量會逐漸減少，從而引發高原缺氧問題。正常成年人腦重占體重2%左右，但其耗氧量卻達到了全身耗氧量的20%，而且腦組織的代謝主要以高耗氧的有氧代謝為主，對缺氧十分敏感[2-3]，因此，在高原低氧環境下，高級神經活動的改變往往出現的較早且較為明顯。作為大腦邊緣系統的組成部分，海馬區主要負責記憶的存儲轉換、信息鞏固和空間定向等功能，在認知功能中發揮關鍵性作用[4]，而海馬區對低氧有選擇性易感性[5]。因此研究低氧環境下富氧干預對海馬結構以及認知功能的影響很有必要。同時，大量文獻表明[6-9]，睡眠有助于長時程增強的形成，進而促進記憶（尤其是空間記憶）的鞏固，因此我們主要對低氧大鼠在睡眠期間進行富氧干預。本研究采用小型動物實驗用環境模擬艙模擬高原環境，使用膜法氧氣機結合獨立通氣籠盒（Individual Ventilated Cages，IVC）提供富氧干預，針對急性低壓低氧環境和富氧干預對SD大鼠認知功能及海馬體的影響進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用健康SPF級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，7周齡左右，體重（211.40±18.58）g，均由空軍軍醫大學動物實驗中心提供。領取大鼠后在實驗室飼養3 d適應環境，實驗室明暗交替為12 h:12 h，采用空調24 h通風，溫度控制在20℃左右，相對濕度控制在40%～70%，保證飲水充足，在保證不斷食的情況下每次給食之間不出現剩余。

1.2 實驗儀器

實驗所用小型動物實驗用環境模擬艙由空軍軍醫大學軍事生物醫學工程學系與蘇州市利安特醫療設備有限公司聯合研制，該設備艙體為鋼化玻璃，便于觀察記錄艙內實驗過程，通過交替繼電器控制兩個真空泵以1 h為周期輪換工作對艙體進行抽氣，設置粗調、微調兩個氣源調節閥調整艙體進出氣比例以達到模擬高原低壓低氧環境，裝配有指針式壓力表和控制顯示面板雙重監測艙體內壓力[10]，內置溫濕度監測顯示儀。

實驗所用便攜式膜法氧氣機是由空軍軍醫大學軍事生物醫學工程學系軍隊衛生裝備教研室自主研制，主要由風機、過濾網、真空泵、富氧膜組件和氣體緩沖室組成，根據膜法富氧技術，以空氣為原料，真空泵產生負壓使空氣通過富氧膜組件后得到富氧空氣[11]，富氧濃度為（30%±3% V/V），流量為（6±1）L/min。課題組通過大量模擬高原環境與高原地區實地測試發現，該氧氣機能顯著改善急進高原人群心率、血氧飽和度、PWC170、抗氧化應激能力等一系列生理指標，能夠有效提高急進高原人群的抗缺氧能力，極大減少高原反應的發生[12-15]。

實驗所用上海移數信息科技有限公司生產的Morris水迷宮系統可以自動監測、記錄、分析動物行為實驗過程，水池直徑為2 m，水深0.5 m，分為四個象限，平臺設置在水下2 cm，并用食物色素染黑水池便于記錄白色大鼠行為軌跡及掩蓋平臺。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

對30只SD大鼠編號后采用隨機數字表法完全隨機分為三組：平原對照組（NC組）、低壓低氧組（LO組）、低壓富氧組（HO組），每組10只。

1.3.2 定位航行訓練

正式開始實驗前一天，讓大鼠適應性游泳2 min（取下平臺），以適應實驗環境，然后對三組大鼠同時進行為期5天的獲得性定位航行訓練，每只大鼠每天訓練4次，每次訓練最長時間為1 min，記錄大鼠找到并爬上平臺的潛伏期（逃避潛伏期），如果1 min后仍未找到平臺，則引導其到達平臺并站立10 s，每天訓練結束后擦拭烘干大鼠身上水分后放歸實驗室繼續飼養。第6天將大鼠按分組進行不同條件干預。

1.3.3 模擬高原環境及富氧干預環境的建立

利用小型動物實驗用環境模擬艙模擬海拔6000 m建立缺氧環境，利用便攜式膜法氧氣機結合IVC籠盒建立富氧環境，在海拔6000 m時籠盒內氧氣濃度為28.4%（上下浮動不超過0.5%），同時在富氧籠盒內放置CO2吸附劑，控制CO2濃度在5%以下。定位航行訓練結束后將LO組置于低壓艙內、將HO組置于低壓艙內的富氧籠盒內、將NC組置于低壓艙外進行飼養。其中富氧組每天富氧時間為12 h，其余時間飼養于低壓艙內，考慮到大鼠晝伏夜出，富氧干預設置在白天，主要模擬高原人群睡眠時間進行富氧干預。保證三組大鼠食水充足，定時更換墊料。

1.3.4 空間探索能力測試

分組干預3 天以后分別測試三組大鼠空間探索能力，將Morris水迷宮內水下平臺撤去，選擇目標平臺兩側象限將大鼠分兩次放入水池，記錄2 min內大鼠穿越平臺次數，計兩次穿越平臺次數平均值作為空間記憶能力指標，實驗過程如圖1a所示。

1.3.5 大鼠海馬CA1區病理觀察

空間探索測試結束之后立即對大鼠進行10%水合氯醛麻醉，冰上取海馬組織，浸泡于4%甲醛溶液內，待完全固定后，使用不同濃度乙醇進行梯度脫水后用石蠟包埋，采用蘇木精—伊紅染色（HE染色）后，在光鏡下觀察其病理改變。每組選取5個400倍CA1視野進行拍照并記錄變性錐體細胞數。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 空間探索能力

空間探索實驗（圖1a）結果顯示，LO組大鼠穿越平臺次數（2.55±0.64）顯著低于 NC 組（6.75±0.95）（P＜0.05）和HO組（6.20±0.79）（P＜0.05），HO組和NC組間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1b。

圖1 Morris水迷宮和穿越平臺次數統計

2.2 腦組織病理形態學改變

大鼠海馬CA1區HE染色結果，見圖2a，可以看出NC組海馬錐體細胞形態規則，排列整齊密集，胞核大而圓，染色呈均勻淡藍色或藍色，核仁清楚，細胞質豐富，層次及細胞線清晰。LO組海馬錐體細胞排列散亂，胞核體積縮小，染色加深，與胞質界線不清，出現大量空泡樣變。HO組海馬錐體細胞結構損傷顯著減輕，排列方式相對整齊，與NC組對照無顯著差異。每組選取5個400倍CA1視野進行拍照并記錄變性錐體細胞數，統計學分析結果顯示，模擬6000 m海拔高原環境LO組海馬CA1區錐體細胞變性數（73.60±19.79）明顯多于 NC 組（3.80±2.39）（P＜0.05）和HO組（3.40±3.21）（P＜0.05），HO組和NC組間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2b。

圖2 海馬CA1區HE染色典型性光鏡照片和椎體細胞變異數統計

3 討論

高原地區自然環境特殊，晝夜溫差大、紫外線輻射強、干燥等氣候特征都會對急進高原人群造成一定的影響，但屬低氧帶來的各種急慢性高原反應對人體健康威脅最大。加上隨著交通的日益便利，人們進入高原的節奏大大加快，因此研究急性低壓低氧環境對人體腦—體功效方面的影響以及尋找可靠有效的應對措施就顯得尤為重要。大量研究表明，急性低壓低氧環境會對動物海馬組織造成一定的病理改變，并引起其空間學習和記憶等認知功能損傷，嚴重時可導致腦死亡[16-18]。付中偉等[19]將20只SD大鼠隨機分為平原對照組和模擬6000 m海拔低氧暴露7 d、每天暴露12 h，結果發現低氧組大鼠穿越平臺次數明顯小于對照組（P＜0.05）。史清海等[20]將56只SD大鼠隨機分為平原對照組和模擬6000 m海拔低氧暴露2、4、6、8、10、12 d組，之后對各組進行Morris水迷宮定位航行訓練和空間探索測試，結果發現各低氧組大鼠穿越平臺次數均顯著少于對照組（P＜0.05），且低氧暴露2 d組穿越平臺次數最少。是文輝等[21]將50只SD大鼠隨機分為常壓對照組和模擬5000 m海拔急性低壓低氧暴露1、2、3、7 d組，結果發現暴露3 d組大鼠腦組織病理學改變最為顯著，但隨著暴露時間的延長，這種損傷程度會有所降低，這可能和低氧習服機制有關。

我們的實驗結果在低氧組的趨勢與上述研究具有一致性。更重要的是我們發現Morris水迷宮空間探索測試結果表明，模擬6000 m海拔高度急性低壓低氧暴露會導致大鼠空間記憶功能障礙，而采用膜法氧氣機在睡眠期間進行富氧干預能顯著減輕低氧帶來的認知功能損傷。進一步分析海馬形態結構可知，低氧組大鼠海馬CA1區椎體細胞變性數量顯著增加，而富氧組與平原對照組無顯著差異。這說明在急性低壓低氧環境下采用膜法氧氣機進行富氧干預能有效減輕低氧對神經系統的結構損傷，從而在一定程度上保證了其能完成正常的學習記憶等認知功能。當然，低氧導致認知功能障礙的原因錯綜復雜，而富氧干預帶來的改善也不止于此，本實驗僅探索到其中的一小部分，還需要進行更加深入地研究。

4 結論

以往解決高原缺氧問題的相關研究大多集中在藥物治療方面，而隨著便攜式膜法氧氣機的成熟和普及，很快就以其使用便捷、見效快、無副作用、人群普遍耐受等優勢備受歡迎，對膜法氧氣機的應用研究也越來越多。本文通過研究模擬急性低壓低氧環境對大鼠認知功能的弱化以及海馬CA1區病理改變，確定采用膜法氧氣機進行富氧干預能有效保護其海馬神經元細胞，并使其認知功能顯著提高甚至達到平原水平，為膜法氧氣機的應用效果提供了有效實驗依據，也為下一步進行人體實驗奠定理論基礎。