模擬酸雨高溫脅迫對桂花品種 ‘杭州黃’抗氧化酶活性和非結構性碳代謝的影響

王小東，汪俊宇，周歡歡，傅盧成，王 彬，張汝民，高 巖

（浙江農林大學 林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

葉綠素是光合作用中支持植物生長的必需物質，也是各種環境脅迫對葉片功能和健康損害的敏感指標［1-2］。酸雨直接通過破壞質膜、降解葉綠素、破壞葉綠體超微結構和使植物關鍵酶失活而抑制植物的生長發育［3］。 酸雨可使植物細胞中氫離子（H＋）濃度升高［4］， 引起過氧化氫（H2O2）和超氧陰離子自由基（O2·-）等活性氧（reactive oxygen species,ROS）的過度積累，高水平的ROS會對細胞結構造成包括脂質過氧化在內的顯著損害［5-6］。植物抗氧化系統，包括抗氧化酶和非酶抗氧化劑，是ROS的清除和細胞膜穩定性的維持重要的防御機制［7］。其中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）是抗氧化的第1道防線，它催化超氧陰離子歧化生成過氧化氫和氧氣，過氧化氫酶（catalase,CAT）是公認的第2道防線，能夠清除細胞中產生的過氧化氫［8］，過氧化物酶（peroxidase,POD）能在高濃度氧的情況下保持較高的氧化還原活性，保護細胞免受高濃度氧的傷害［9］。非結構性碳水化合物（nonstructural carbohydrate,NSC）主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉等，是重要的滲透調節物質和能量物質［10］。李天紅等［11］對蘋果Malus domestica研究發現：適度水分脅迫處理使葉片和根系中蔗糖含量升高，淀粉含量顯著降低；BOLOURIMOGHADDAM等［12］研究認為葡萄糖代謝可以通過清除ROS從而防止細胞程序性死亡。環境脅迫導致初級代謝紊亂，影響可溶性糖的積累?？扇苄蕴浅俗鳛榇x物質和能量來源外，還充當信號分子，協調合成代謝和分解代謝過程，促進植物生長發育。酸雨被認為是一種世界性的污染物，尤其是在北歐、北美和中國。中國酸雨污染面積占國土面積的40%以上，強酸雨區（pH≤4.5）面積居世界三大酸雨區之首，其中長江以南地區已成為全球強酸雨中心［13-14］。長江中下游地區受副熱帶高壓影響，梅雨季節過后常常伴隨著高溫，導致該地區植物易遭受酸雨和高溫雙重脅迫。桂花品種 ‘杭州黃’Osmanthus fragrans‘Hangzhou Huang’是木犀科Oleaceae木犀屬Osmanthus的常綠喬木，是新培育的珍貴品種。為了研究‘杭州黃’對酸雨高溫雙重脅迫的響應，模擬酸雨高溫脅迫對非結構性碳質量分數、ROS及抗氧化酶活性的影響，揭示 ‘杭州黃’抵御酸雨高溫脅迫的生理生化指標響應機制，以及 ‘杭州黃’抗酸雨高溫脅迫的適應對策，同時為植物多樣性保護、園林植物合理利用及可持續發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年6月，將生長良好、長勢基本一致的2年生 ‘杭州黃’實生苗（購于浙江杭州畫境種業有限公司， 苗高約 50 cm）栽植于盛有培養土［V（泥炭）∶V（沙土）∶V（蛭石）=1∶2∶1， 干質量為 1.5 kg］花盆中（φ=25 cm，h=30 cm），1株·盆－1，共計40盆。盆栽苗常規管理，光照條件為自然光，緩苗期間，用自來水進行澆灌。充分緩苗1個月，再實施酸雨高溫處理。

1.2 試驗處理

選取盆栽苗40盆，隨機分為8組，其中4組用作酸雨處理，另4組酸雨處理后再進行高溫處理。酸雨處理：母液根據浙江省杭州市臨安區酸雨監測分析資料，按照酸雨中x［硫酸根離子（SO42－）］∶x［硝酸根離子（NO3－）］=4∶1（摩爾比）的比例配制。 設置 pH 5.6（對照）， pH 4.0， pH 3.0， pH 2.0 等 4 個處理梯度，酸雨噴施量根據臨安區月均降水量，5 d噴施1次，噴施5 mm·次－1，連續處理40 d。處理結束后，選取桂花枝條從上至下第3對完整的功能葉片，取樣3.0 g·盆-1（約10個葉片），一部分新鮮葉片立即用做光合色素的測定，另一部分樣品用液氮迅速冷凍后保存于－80℃超低溫冰箱中待測定。高溫處理：將對照組和每個酸雨處理后的苗木，放入人工氣候箱 （晝/夜為40℃/28℃，濕度為40%，光合光子照度為400.0 μmol·m－2·s－1）， 脅迫2 d。 將對照組進行高溫脅迫作為高溫組， 其他作為酸雨高溫協同處理組。5盆·處理－1，每盆作為1個獨立實驗，共5次重復。

1.3 試驗方法

1.3.1 光合色素質量分數的測定 光合色素的測定參照ARNON［15］的方法并略作改進，根據LICHTENTHALER［16］的方法分別計算。

1.3.2 ROS和丙二醛（MDA）質量摩爾濃度的測定 O2·－測定參照李忠光等［17］的研究方法并稍作改進。過氧化氫測定參照CHANDRA等［18］的方法并略作改進。MDA測定參照HODGES等［19］的方法。

1.3.3 抗氧化酶活性的測定 酶液提取方法：稱取0.5 g冷凍樣品，用液氮磨碎，加入9.0 mL磷酸緩沖溶液（0.1 mol·L－1， pH 7.4）研磨成勻漿， 10 000×g離心 15 min（4℃）。 取上清液用于 SOD， POD 和 CAT活性的測定。SOD活性測定參照南京建成生物科技有限公司生產的A001-1型SOD試劑盒進行測定和計算。CAT和POD活性測定參照KUMARI等［20］的方法。

1.3.4 非結構性碳質量分數的測定 取植物材料0.5 g，用液氮磨碎，加入10.0 mL蒸餾水研磨成勻漿，100℃水浴10 min，冷卻，3 000 r·min－1離心5 min，上清液為可溶性糖提取液。向沉淀中加體積分數為80%乙醇沖洗1遍，加蒸餾水3.0 mL，攪拌均勻，放入沸水浴中糊化15 min。冷卻后，加入4.0 mL冷的9.2 mol·L－1高氯酸，攪拌，提取20 min后加蒸餾水至25.0 mL，混勻，離心10 min，上清液為淀粉提取液。蔗糖、果糖和葡萄糖參照南京建成生物科技有限公司生產的試劑盒進行測定和計算。淀粉采用蒽酮比色法測定。

1.4 數據處理

所有數據均為5次重復的平均值±標準誤，利用Origin 9.0軟件進行數據處理、圖表制作和統計分析，統計方法采用單因素方差分析（one way ANOVA）進行Turkey多重比較。

2 結果與分析

2.1 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’光合色素的影響

由表1看出：隨著酸雨強度的增加，葉綠素a（Chl a）質量分數，總葉綠素（Chl t）質量分數和Chl a/b均呈降低趨勢，pH 2.0處理分別比對照降低了16.9%，16.0%和4.8%（P＜0.05）。高溫脅迫后，葉綠素a質量分數，總葉綠素質量分數和Chl a/b分別比對照降低了12.4%，10.8%和7.7%（P＜0.05）。酸雨高溫協同脅迫后，葉綠素a質量分數，總葉綠素質量分數和Chl a/b進一步降低，pH 2.0時分別比對照降低了27.7%， 23.8%和 19.5%（P＜0.05）。

2.2 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’ROS和MDA質量摩爾濃度的影響

由表2可見：隨著酸雨強度的增加，過氧化氫和O2·－質量摩爾濃度逐漸增加，在pH 2.0時分別比對照增加了94.5%和140.9%（P＜0.05）；MDA先增加后降低，pH 3.0時比對照增加了75.0%（P＜0.05）。高溫脅迫后，過氧化氫、O2·－和MDA質量摩爾濃度分別比對照增加了87.3%，120.9%和75.8%（P＜0.05）。酸雨高溫協同脅迫后，隨著pH值的增加，過氧化氫質量摩爾濃度呈先增加后降低的趨勢，在pH 3.0時達最大值，比對照增加了180.1%（P＜0.05）；O2·－和MDA質量摩爾濃度呈上升趨勢，pH 2.0時分別比對照增加了158.3%和142.0%（P＜0.05）。

表1 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’光合色素的影響Table 1 Effects of acid rain and heat stress on pigment contents in leaves of Osmanthus fragrans ‘Hangzhou Huang’

表2 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’葉片ROS和MDA質量摩爾濃度的影響Table 2 Effects of acid rain and heat stress on ROS and MDA contents in leaves of O.fragrans ‘Hangzhou Huang’

2.3 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’抗氧化酶活性的影響

從圖1A可以看出：隨著酸雨強度的增加， ‘杭州黃’葉片的SOD活性先增加后降低，在pH 3.0時比對照增加了48.9%（P＜0.05），隨后略微降低。由圖1B和圖1C可知：POD和CAT活性隨酸雨脅迫強度加強均逐漸增加，pH 2.0處理分別比對照增長了79.6%和118.2%（P＜0.05）。高溫脅迫后SOD，CAT和POD活性分別比對照增加了54.5%，64.1%和43.8%（P＜0.05）。

圖1 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’葉片抗氧化酶活性的影響Figure 1 Effects of acid rain and heat stress on activity of antioxidant enzymes in leaves of O.fragrans ‘Hangzhou Huang’

酸雨高溫協同脅迫下，隨脅迫強度的增加，SOD和CAT活性呈先增加后降低趨勢，均在pH 4.0處理達最大值，分別比對照增加了60.3%和92.9%（P＜0.05）；POD活性仍逐漸增強，pH 2.0處理比對照增加了107.3%（P＜0.05），說明酸雨高溫脅迫后主要靠POD發揮抗氧化作用減少自由基對植物造成的傷害。

2.4 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’非結構性碳質量分數的影響

由圖2可見： ‘杭州黃’葉片葡萄糖質量分數在酸雨脅迫后變化不顯著；高溫脅迫后，葡萄糖質量分數比對照降低了10.2%（P＜0.05）；酸雨高溫協同脅迫后，葡萄糖質量分數隨著酸雨強度的增加而減小，pH 2.0處理比對照降低了22.4%（P＜0.05）。

果糖質量分數隨著pH值的降低呈先升高后降低趨勢，pH 2.0處理較pH 4.0降低了18.6%（P＜0.05）；高溫脅迫后，果糖質量分數比對照降低了13.5%（P＜0.05）；酸雨高溫協同脅迫后，果糖質量分數隨著酸雨強度的增加而減小，pH 2.0處理比對照降低了38.1%（P＜0.05）?？梢钥闯?，脅迫程度較輕時，果糖質量分數較穩定，重度脅迫后則顯著降低。

蔗糖質量分數在pH 2.0脅迫后顯著降低，比對照減少了18.9%（P＜0.05）；高溫脅迫后，蔗糖質量分數比對照降低了13.8%（P＜0.05）；酸雨高溫協同脅迫后，蔗糖質量分數隨著pH值的降低而減少，pH 2.0處理比對照降低了41.6%（P＜0.05）。由此可見，單一酸雨和高溫脅迫時，蔗糖質量分數降幅較低；隨著協同脅迫程度的加深，蔗糖質量分數顯著降低。

淀粉質量分數隨pH值的降低呈下降趨勢，pH 2.0處理比對照減少了26.8%（P＜0.05）；高溫脅迫后，淀粉質量分數比對照降低了25.3%（P＜0.05）。酸雨高溫協同脅迫后，淀粉質量分數逐漸減少，pH 2.0處理比對照降低了40.1%（P＜0.05）。

圖2 酸雨高溫脅迫對 ‘杭州黃’葉片非結構性碳質量分數的影響Figure 2 Effects of acid rain and heat stress on non-structural carbohydrate contents in leaves of Osmanthus fragrans ‘Hangzhou Huang’

3 討論與結論

植物葉片是捕獲轉換光能和制造有機物的最重要器官［21］，植物葉綠素含量變化直接影響其光合作用過程［22］。干旱［23］、高溫和酸雨［24］等非生物脅迫導致植物葉綠素減少。在酸雨pH≤3.5的環境條件下，龍眼Dimorcarpus longana ‘Wulongling’葉片總色素含量和Chl a/b均下降［25］。本研究結果顯示： ‘杭州黃’葉片葉綠素a質量分數及Chl a/b在酸雨或高溫單一脅迫后均明顯下降，協同脅迫后進一步降低，說明酸雨高溫脅迫導致葉片光合色素結構破壞，影響植物光合作用能力，協同脅迫對葉綠素破壞更大。

植物受到傷害時會導致細胞內ROS大量積累［26］，促進膜脂過氧化作用加強，產生大量MDA，最終導致細胞膜功能受損，質膜透性增加［27］，因此MDA質量摩爾濃度的高低可迅速反映出植物受逆境傷害的程度［28］。吳永波等［29］研究發現：高溫或干旱脅迫后構樹Broussonetia papyrifera幼苗ROS和MDA質量摩爾濃度增加，復合脅迫后ROS和MDA質量摩爾濃度均顯著高于單一脅迫。本實驗結果表明：酸雨或高溫單一脅迫后ROS和MDA質量摩爾濃度均顯著增加，說明受到酸雨及高溫不同脅迫后， ‘杭州黃’體內產生大量的ROS對細胞膜造成傷害。酸雨高溫協同脅迫后，O2·－和MDA質量摩爾濃度進一步增加，過氧化氫質量摩爾濃度先增加后減少，說明協同脅迫加劇對植物的傷害，與前人研究結果一致。

植物體內的SOD，CAT和POD等3種酶是細胞抵御活性氧傷害的重要保護性酶。它們在清除O2·－，過氧化氫和過氧化物，阻止和減少自由基的形成，從而保護膜系統免受損傷方面起著重要作用。研究表明：酸雨脅迫后，茶梅Camellia sasanqua葉片SOD，POD和CAT活性提高［30］，以消除ROS維持體內的氧化還原平衡；牛遠等［31］研究發現高溫脅迫后華北落葉松Larix principis-rupprechtii幼苗 SOD和POD活性呈先上升后下降的趨勢，CAT活性呈降低趨勢。本研究結果顯示：隨酸雨脅迫處理強度的增加，SOD，CAT和POD活性逐漸增強；高溫脅迫后，3種酶活性顯著增加，但SOD活性高于pH 2.0處理，CAT和POD低于pH 2.0處理。協同脅迫后，POD活性進一步增強，SOD和CAT活性先升高后降低，說明協同脅迫初期3種酶共同作用，使植物體內ROS代謝平衡維持在正常水平，防止發生進一步氧化損傷；POD活性在協同作用后期對過氧化氫清除起主導作用，在高強度的酸雨高溫條件下，POD清除ROS的效率更高，而pH 3.0處理下SOD和CAT活性表達受到抑制，且過度脅迫導致一部分已經表達的CAT失活，說明抗氧化酶減輕膜脂過氧化傷害的作用是有限的。

植物光合作用產生的非結構性碳水化合物，既是植物生長發育必需的能量物質，也是細胞內重要的滲透調節物質［10］。近年來越來越多的研究表明碳水化合物也是一種信號分子，通過光合氮同化形成復雜的信號網絡，對植物的基因表達、逆境響應、生長發育進行調控［32］。已有研究表明：各種脅迫引起的糖限制可能是ROS積累的重要基礎［12，33］，BOLOURI-MOGHADDAM等［12］發現葡萄糖能夠通過磷酸戊糖途徑和產生非酶性抗氧化劑，有效清除活性氧，提高植物抵抗能力；蔗糖代謝不僅為植物發育提供能量和碳骨架，還通過提供己糖作為必需代謝物和信號分子來調節它們對非生物脅迫的響應［34］；童貫和等［35］指出：5種不同酸雨處理下的小麥Triticum aestivum幼苗莖葉可溶性糖含量分別下降15.4%～29.4%，差異達極顯著水平。本實驗結果顯示：酸雨脅迫后 ‘杭州黃’蔗糖和淀粉質量分數顯著降低，而葡萄糖和果糖質量分數相對穩定，可能是因為植物遭受脅迫時呼吸代謝增強，蔗糖和淀粉分解為葡萄糖和果糖提供能量物質，增加抵抗能力。高溫脅迫后非結構性碳質量分數均顯著降低，可能是因為高溫促使植物呼吸代謝加速，葉片非結構性碳消耗速率大于合成速率。協同脅迫后非結構性碳質量分數進一步降低，一方面因為葉綠體膜結構受損，光合作用能力下降，引起植物體內非結構性碳積累速度降低，另一方面有些糖類通過代謝途徑和產生非酶抗氧化劑，清除過量的ROS，減輕脅迫造成的傷害。

綜上所述，在酸雨脅迫后， ‘杭州黃’葉片內產生大量ROS對細胞膜及光合能力造成傷害，植物抗氧化酶活性提高有效清除ROS，減輕脅迫造成的傷害；高溫脅迫后呼吸作用加快，可溶性糖和淀粉降解，為抵御脅迫提供能量和碳源；協同脅迫后傷害進一步加深，SOD和CAT活性逐漸降低，POD保持較高活性繼續發揮抗氧化功能，同時通過調節非結構性碳代謝參與應激反應，提供能量并消除過量的ROS，表現出較強的抵御酸雨高溫脅迫的能力。