蛋白質動態運動在生物化學實驗中的教學實踐

史 影, 王偉偉, 葉伶燕, 周耐明

(浙江大學 生命科學學院, 浙江 杭州 310058)

當前高校生物化學實驗教學的內容主要以體外非細胞體系的檢測性實驗為主,如酶的活性檢測、蛋白質濃度測定、酶促反應動力學以及聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量等等,對于細胞內蛋白質的動態變化及運動涉及很少。利用G蛋白偶聯受體內吞原理,通過熒光蛋白顯微成像技術,讓學生觀察并實踐了受體蛋白在細胞中的內吞過程和回膜運動,同時還觀察了下游招募蛋白的定位和運動。該實驗模型還可用于膜受體內吞機制的基礎研究以及受體藥物篩選,是個值得推廣并便于實踐的生化實驗。

1 實驗原理

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是一類高度保守的細胞膜蛋白超家族,廣泛存在于從真菌到哺乳動物的生命體中。細胞外信號通過GPCRs將信息傳遞至細胞內并通過效應系統發揮廣泛調控作用[1]。GPCRs 與人類疾病如肥胖、糖尿病、骨質疏松、腫瘤、炎癥、甚至 HIV 病毒感染等都密切相關,所以 GPCRs一直也是研發新藥的主要藥靶[2-3]。當GPCRs的激動劑持續存在時,會在幾分鐘至幾小時內引起細胞膜表面的受體數量降低,即發生內吞(internalization)。隨后,GPCRs會出現反應性降低的現象，即受體失敏(desensitization)[4-6]。GPCRs的內吞及失敏是調節GPCRs介導的信號轉導及效應的重要機制。內吞后受體通常有兩種去路,一是通過內含體(endosome)再循環回到細胞膜表面,完成復敏;二是被送到溶酶體中發生不可逆的降解[7]。

GPCRs的內吞過程伴隨一系列分子事件。在特定激動劑誘導下,GPCRs構象發生改變,構象改變后的受體被第二信使依賴的激酶PKA、PKC等或G蛋白偶聯受體激酶GRKs識別并發生快速磷酸化。磷酸化后的受體招募β-arrestins從細胞質轉位至細胞膜。GPCRs與arrestins的結合引起arrestin構象改變,促進其C端結構域暴露,暴露的C端結構域進一步與籠型蛋白(clathrin)和籠型蛋白適配器AP-2(adaptor protein complex-2)的β2銜接蛋白亞基(β2-adaptin subunit)發生相互作用。接著該復合體通過網格蛋白包被的小窩(clathrin coated pits, CCPs)在dynamin的發動下發生內吞[8-11]。

受體內吞模型研究常用綠色熒光蛋白GFP作為重要工具。GFP有2個吸收峰,主峰在395 nm,次峰在470 nm,其熒光發射峰在509 nm。GFP的突變體增強型熒光蛋白EGFP(enhanced green fluorescent protein)改善了GFP在37 ℃的折疊能力,顯著提高了GFP的光譜性質,并大大增強了熒光強度和光穩定性。突變后的EGFP激發峰轉移至488 nm,而發射峰仍保持在509 nm,這和常用的FITC濾光片匹配,提高了GFP的應用潛力[12-13]。本實驗通過常規的基因操作,將趨化因子受體FPR1與EGFP在細胞中融合表達,觀察FPR1的細胞內定位及內吞過程,以及對β-arrestins的招募作用。

2 實驗步驟

2.1 質粒提取及檢測

實驗所用質粒為FPR1-pEGFP、PCMV-FPR1、β-arrestin1-pEGFP、β-arrestin2-pEGFP。將所用質粒轉化至大腸桿菌中,搖菌擴大培養。用去除內毒素的質粒提取試劑盒提取相關質粒,用紫外分光光度法對所提質粒進行定性定量分析。

2.2 細胞培養

實驗所用細胞株為人胚胎腎細胞HEK293,用含10%FBS的DMEM/Low Glucose培養基,在37 ℃,5%CO2培養箱中培養。待細胞匯合度達到80～90%時,以1∶3～1∶5的稀釋度傳代。

2.3 轉染

將處于良好生長狀態的HEK293細胞,以3×105～5×105的密度接種于6孔培養板中。在37 ℃,5%CO2培養箱中繼續培養18～24 h,待細胞匯合度達到80%～90%時,選用Lipofectamine 2 000進行轉染。轉染后培養4～6 h換新鮮培養基,繼續培養8～12 h。

教師推薦轉染方案,6孔板中的其中2孔細胞轉染FPR1-pEGFP,用于直接觀察FPR1-GFP受體蛋白的內吞,2孔細胞共轉染PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP,另兩孔細胞共轉染PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP,后四孔細胞用于觀察FPR1被配體激活后輔助蛋白β-arrestins的動態變化。學生可根據自己的設計調整方案。

2.4 受體定位及內吞研究

2.4.1 細胞準備

將6孔板中轉染后的HEK293細胞,平均分配于事先置有滅菌蓋玻片的6孔板中,讓細胞在蓋玻片上生長。37 ℃,5%CO2培養箱中培養18～24 h,使在進行實驗的當天細胞達到70%～80%的匯合度。其中2孔提前加入蛋白質合成抑制劑放線菌酮過夜培養。

2.4.2 激動劑刺激和細胞固定

加5 μM FPR1激動劑fMLP于FPR1-pEGFP轉染細胞中分別孵育0、5、30、45 min,用于觀察激動劑處理不同時間受體蛋白的定位及內吞運動；配制不同濃度的激動劑fMLP(用DMEM稀釋),作用于FPR1-pEGFP轉染細胞,于37 ℃,5%CO2培養箱中孵育45 min,用于觀察不同濃度激動劑對FPR1受體內吞的影響；在放線菌酮處理的細胞中加入激動劑刺激45 min,再去除激動劑,1 h后觀察受體蛋白的去路。

在PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP, PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP 共轉染細胞中,加入激動劑fMLP,作用不同時間,觀察β-arrestin1和β-arrestin2的定位及變化。

孵育完畢后將細胞培養基從待檢細胞中吸出, 用PBS 漂洗細胞。漂洗后, 4%多聚甲醛室溫固定10 min,將玻片從6孔板中取出,置于事先滴有甘油的蓋玻片上,封片。

2.4.3 細胞定位及內吞觀察

熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白的分布。

3 實驗結果討論

3.1 觀察激動劑作用不同時間FPR1從細胞膜到胞漿的內吞運動

用FPR1激動劑fMLP(5 μM)刺激轉染有FPR1-pEGFP的細胞,37 ℃,5%CO2培養箱中分別孵育0、5、30、45 min,熒光顯微鏡或confocal觀察FPR1-pEGFP融合蛋白的定位。結果如圖1所示,0 min即不加激動劑時,受體蛋白主要表達在細胞膜上；5 min時部分受體蛋白已形成顆粒狀向細胞內遷移即內吞,但細胞膜上還存有部分受體蛋白；30 min時,內吞顆粒增加且進入細胞更內部；45 min后絕大部分受體蛋白集中在胞漿某一區域,細胞膜上基本看不到受體蛋白。圖1中清楚地展示了膜受體蛋白的內吞過程。

圖1 激動劑處理不同時間的FPR1-pEGFP內吞

3.2 觀察不同濃度激動劑作用于FPR1后,引起的FPR1受體內吞

用不同濃度(1 μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L)的FPR1激動劑fMLP刺激轉染有FPR1-pEGFP的細胞,37 ℃,5%CO2培養箱中孵育45 min,熒光顯微鏡或confocal觀察FPR1-pEGFP融合蛋白的定位。結果如圖2所示,在低濃度10 nmol/L激動劑刺激下,受體蛋白基本沒有內吞,在100 nmol/L時有部分內吞,1 μmol/L時幾乎全部內吞。由此理解受體蛋白內吞數量與激動劑濃度正相關的內在機制。

圖2 不同濃度激動劑處理下FPR1-pEGFP的內吞

3.3 觀察FPR1受體內吞后,撤去激動劑1 h后受體蛋白的去路

內吞后的受體通常有2條去路,到溶酶體中被降解或重新回到膜上發揮功能。具體采用哪條去路與受體的性質有關。在用放線菌酮預處理細胞,抑制新受體蛋白合成的情況下,激動劑刺激45 min使受體內吞,然后換液撤去激動劑,1 h后發現內吞的FPR1重新回到細胞膜上,說明內吞后的FPR1受體會重新回到細胞膜再循環使用，見圖3所示。

圖3 FPR1受體內吞后去路觀察

3.4 觀察FPR1受體內吞過程中,β-arrestin1和β-arrestin2的運動變化

將PCMV-FPR1和β-arrestin1-pEGFP, PCMV-FPR1和β-arrestin2-pEGFP 分別共轉染至細胞中,加激動劑fMLP作用不同時間,結果如圖4所示。在0 min即不加激動劑時,β-arrestin1和β-arrestin2主要分布在胞漿中,激動劑加入1 min時β-arrestin1已向細胞膜分布,到5 min時細胞膜定位更明顯,隨著時間的延長,到15 min時,β-arrestin1重新回到胞漿；在激動劑處理過程中β-arrestin2也出現了胞漿-細胞膜-胞漿的運動過程,1 min時細胞膜定位最明顯,5 min時已向胞漿遷移。該實驗反映了β-arrestin1和β-arrestin2蛋白都參與了FPR1受體內吞過程,且并不完全同步,相關機制還可設計實驗做進一步研究。

圖4 FPR1受體內吞過程中β-arrestin1和β-arrestin2的招募

4 實驗安排及效果

本實驗安排在高級生物化學實驗課程中,可連續4～5 d,共12～18 h。中間設置開放環節,如激動劑濃度選擇,處理時間選擇,對照設置,FPR1與其他下游蛋白的相互作用等,或者學生其他感興趣的環節。實驗過程強調直觀現象與分子機制的契合理解,實驗對照組的設置,拓展性實驗的思考,并學習正確的熒光蛋白顯微成像技術。多年教學實踐顯示該實驗內容豐富、綜合性強、學生學習積極性高。

5 結語

當前熒光蛋白技術被廣泛應用于基因表達調控、蛋白質空間定位和轉運、蛋白折疊、生物分子相互作用等研究領域[14-15]。在本科生高級生物化學實驗中,我們用綠色熒光蛋白EGFP作標記,在熒光顯微鏡或激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察G蛋白偶聯受體FPR1的定位和內吞運動,以及其下游蛋白β-arrestins的招募過程。該實驗一方面使學生觀察到不同條件及動態變化中蛋白質的定位及運動；另一方面,在具體實驗中也學習了相應的蛋白顯微成像技術及圖像處理方法,拓展了生物化學的本科教學實驗內容。另外,由于本實驗結果非常直觀,也有效地調動了學生的實驗積極性和興趣。該實驗對學生進一步認識蛋白質在信號刺激及系列分子事件中的運動及相關機制起到了很好的啟示作用。