腫瘤干細胞的耐藥機制研究進展

王露瑤，呂娟，阮紅杰

(南京醫科大學附屬婦產醫院/南京市婦幼保健院，南京210004)

盡管目前的手術和放化療能夠減小腫瘤的體積和延長患者的生命，但腫瘤復發和多藥耐藥的發生仍是目前腫瘤治療的兩大障礙。腫瘤干細胞(CSCs)理論認為，腫瘤是異質性細胞群體，存在著一小部分類似于胚胎干細胞、具有無限自我更新和分裂能力的類干細胞，調控腫瘤的發生發展[1～3]。常規的放化療主要是針對普通的腫瘤細胞，而CSCs對此并不敏感。同時，隨著放化療的刺激作用及普通腫瘤細胞的清除，改變了CSCs的微環境，CSCs得到富集，增殖侵襲轉移的能力進一步增強，并且對化療藥物表現出更強的耐藥性，對藥物的敏感性降低，甚至無反應，導致腫瘤的復發，說明CSCs在腫瘤耐藥中發揮了重要作用。對CSCs耐藥機制的研究將有助于腫瘤治療新思路的開拓。研究[4]發現，CSCs主要通過自身的生物學特性和腫瘤微環境的保護作用而在腫瘤耐藥中發揮作用，現將相關研究進展綜述如下。

1 CSCs的生物學特性

美國癌癥研究協會(AACRl3)定義CSCs為：腫瘤中能夠自我更新，并產生異質性腫瘤細胞的細胞。研究[2,6]顯示，將少量的CSCs種植于小鼠體內能重塑整個腫瘤的表型，因此常常導致腫瘤的復發、耐藥和轉移。和正常的干細胞一樣，CSCs高表達干性基因NANOG、OCT4、SOX2等，還有干性信號通路的激活，以此維持CSCs的干性，調控腫瘤的發生發展。CSCs的生物學特性決定了CSCs不同于普通的腫瘤細胞。CSCs通常隱匿在癌巢中，處于靜止狀態，DNA復制不活躍，能夠逃避化療藥物誘導的DNA損傷作用，對DNA損傷的修復能力增強，保持基因的穩定遺傳。CSCs的這些生物學特性受到胞內和胞外復雜的調控網絡的控制。

1.1 細胞周期阻滯 CSCs通常處于休眠狀態，增殖不活躍。大部分的化療藥物主要是針對分裂中的腫瘤細胞，這些腫瘤細胞通常處于G2/S期，而CSCs處于G0/G1期，對化療藥物并不敏感。因放化療的作用，消除了普通腫瘤細胞，使CSCs得到富集。同時，也因化療藥物的刺激作用，靜止的CSCs迅速蘇醒，進入細胞周期，迅速增殖分裂，重構整個腫瘤的表型，導致腫瘤復發。CSCs休眠狀態需要自身特性和外部環境因素的共同作用的維持。在對胰腺癌CSCs的研究[7]中發現，耐藥的腫瘤球體細胞中，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21和腫瘤抑制因子P53的表達升高，而細胞周期蛋白D1的表達降低，細胞周期停滯于G0/G1期，對普通化療藥物不敏感，常常導致腫瘤的復發。乙醛脫氫酶1(ALDH1)常常作為CSCs分選標志,可以將醛類氧化成羧酸類，抵抗烷化劑的損傷作用，高表達于CSCs表面。Meng等[8]發現，在卵巢癌CSCs中，ALDH1表達陽性的CSCs對化療藥物的敏感性明顯降低，ALDH1A通過調節KLF4和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑P21蛋白調整細胞周期，細胞停滯于對化療藥物不敏感的G0/G1期，從而抵抗藥物的殺傷作用。此外，糖原合成酶激酶-3(GSK-3)通過Wnt/β-catenin促進β-catenin泛素化，阻斷下游靶標細胞周期蛋白-1、c-Myc等的激活，抑制細胞周期的進程。Haraguchi等[9]發現，生長分化因子15(GD15)可以通過AKT/GSK-3β/β-catenin信號通路增加肝CSCs在G0/G1期的細胞比例，增強肝CSCs的成球能力及對化療藥物的抵抗力。因此，細胞周期阻滯可以保護CSCs抵抗化療藥物的損傷，打破CSCs的休眠狀態可以作為新的治療方向。

1.2 DNA損傷耐受及DNA損傷修復 目前一部分化療藥物是通過誘導腫瘤細胞DNA損傷來發揮殺傷腫瘤細胞作用的，而CSCs不但處于休眠期，還具有極強的DNA損傷耐受及DNA損傷修復能力。其主要機制為，一方面通過切除修復去掉DNA受損部分，另一方面通過增強重組修復稀釋損傷的DNA鏈。腫瘤化療藥物順鉑主要是抑制腫瘤細胞的DNA復制與轉錄，誘導細胞的凋亡。Srivastava等[10]發現，卵巢CSCs中高表達DNA聚合酶Polη，通過促進跨損傷DNA合成，跳過損傷的DNA復制點，可以逃避順鉑的損傷作用。此外，對DNA損傷的修復還可通過增強對DNA雙鏈斷裂(DSBs)的修復來完成。Gold等[11]發現，新型抗癌藥物螺內酯抗腫瘤的作用機制，就是通過抑制腫瘤細胞的DSBs修復來完成的。因為螺內酯對完好的CSCs并不起作用，僅對發生DSBs的CSCs的DNA修復有抑制作用，解除CSCs的DNA損傷耐受、抑制CSCs的DNA修復，可以干擾CSCs的正常分裂，從而消除CSCs，抑制腫瘤的復發及耐藥，提高腫瘤清除率。

1.3 藥物外排 化療藥物發揮殺傷作用需要一定的藥物濃度，CSCs與普通腫瘤細胞相比，細胞內的藥物濃度較低，這與CSCs表面高表達多藥耐藥蛋白(MDR)有關。ABC轉運蛋白家族是一類MDR，即ATP結合盒蛋白，能夠利用ATP水解釋放的能量將治療藥物排出胞外，從而降低細胞內有效的藥物濃度，導致腫瘤的耐藥及復發。此外，ABC轉運蛋白還可作為腫瘤的預后因子，ABC亞家族C成員2(ABCC2)、ABCC3和ABC亞家族G成員2(ABCG2)作為CSCs的標志物，其表達與結腸癌患者的預后相關，可以作為結腸癌預后的預測因子。由于一種藥物可由多種轉運蛋白排出，單獨抑制某一種特定的轉運蛋白，無法阻礙藥物的外排，這也是阻礙靶向藥物成功運用于臨床的一大障礙。Wu等[12]發現，靶向藥物酪氨酸酶抑制劑tepotinib可以抑制ABCB1介導的藥物外排，但是不能阻斷ABCG2、ABCC1的外排作用。因此，進一步探究ABC轉運蛋白的調控機制，對恢復抗腫瘤藥物殺傷作用來說至關重要。

1.4 上皮間質轉化(EMT) EMT，即上皮細胞失去上皮細胞的特性而表達間質細胞的特性，并獲得侵襲轉移的能力。EMT在產生CSCs中起著關鍵作用，與CSCs的生物學特性及耐藥現象緊密相關。目前認為，一部分CSCs由已分化的腫瘤細胞去分化產生。Li等[13]研究表明，調控EMT過程的轉錄因子的上調，如snail、slug等，可以誘導已分化的腫瘤細胞去分化轉化為CSCs，并介導化學抗性。Shuang等[14]發現，發生EMT的惡性腫瘤細胞，干性基因的表達有所增強，表明發生EMT能使腫瘤細胞去分化為CSCs，獲得干性特征。與此同時，CSCs高表達間質細胞標志物。Wang等[15]發現，胰腺癌懸浮球培養的球體細胞高表達干性標志物CD44+、NANOG的同時，snail等EMT轉錄因子的表達也升高。Gao等[16]發現，在肝CSCs中CD44+的肝CSCs高表達間質細胞標志物波形蛋白和N-鈣黏蛋白，而低表達上皮細胞標志物；去除CD44+CSCs,可以通過抑制ERK/Snai信號通路，減少肝癌細胞的轉移。越來越多的證據[17,18]表明EMT與CSCs之間的直接聯系，共同促進腫瘤侵襲、轉移，調控腫瘤的發生發展。EMT是一個動態的、可逆的過程，因此，通過直接靶向作用某個或某幾個EMT相關的轉錄因子，并不能抑制EMT的發生。探究EMT與CSCs之間的作用機制，對腫瘤的治療來說是至關重要的。

2 CSCs生存的腫瘤微環境的特點

CSCs的耐藥除了與其干性特征相關外，還受腫瘤微環境的調節。單個的CSCs無法獨自存活，需要腫瘤微環境的支持。腫瘤微環境不僅包括腫瘤細胞本身，還有與腫瘤相關的基質細胞、微血管、細胞間質和細胞因子。腫瘤微環境是一種動態變化的環境，受腫瘤發生發展的調節。腫瘤的發生發展促腫瘤微環境的形成，微環境的低氧、低PH、微量葡萄糖供應進一步維持CSCs的干性和提高耐藥能力。CSCs的休眠狀態能夠適應微環境中低能量供應，一旦環境發生改變，CSCs能量利用方式隨之改變，進入增殖期擴增腫瘤細胞[19]。所以，CSCs所處的腫瘤微環境是維持干性、驅動腫瘤發展、復發及耐藥的重要因素。同種腫瘤在不同腫瘤微環境中，其基因表達和生物學行為之間具有顯著的差異性，可能與腫瘤微環境的差異相關。鑒于CSCs與腫瘤微環境相互作用關系，腫瘤微環境可以作為腫瘤治療的新的靶點，改變CSCs生存的環境，增加對藥物的敏感性。

2.1 低氧環境 低氧環境是腫瘤微環境的一大特點，是維持CSCs的干性的重要條件。低氧環境可以誘導CSCs的干性、促進EMT的發生以及產生更強的耐藥。低氧環境下眾多的信號通路處于激活狀態，主要是由缺氧誘導因子-1(HIF-1)介導的一系列級聯反應。HIF-1幾乎參與細胞代謝的每個過程，涉及腫瘤的發生、轉移、復發及耐藥。在低氧狀態下，HIF-1降解途徑被抑制，導致HIF-1及其調節的靶基因如NANOG等在CSCs中的表達普遍高于非CSCs[20]。Sun等[21]發現，在低氧環境下，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)/ATK信號通路的活化可以激活HIF-1α，提高CSCs抵抗化療藥物的能力。低氧環境還可以維持CSCs的休眠狀態，抑制細胞凋亡，抵抗藥物的殺傷作用。Li等[22]發現，HIF-2α在神經膠質細胞瘤干細胞中明顯高表達，通過干擾HIF-2α的表達可以促進CSCs的凋亡。

2.2 腫瘤相關成纖維細胞(CAFs) 腫瘤微環境由腫瘤細胞及非腫瘤細胞構成，CAFs、巨噬細胞(M2細胞)是其中最重要的兩種間質細胞，這些細胞能夠分泌不同的細胞因子和生長因子，包括VEGF、IL-10和IL-17等，通過調節CSCs促進腫瘤的進展。CAFs受腫瘤微環境中成纖維細胞生長因子、TGF-β的作用而激活，分泌大量的細胞因子，調節CSCs的增殖、維持CSCc的干性。此外，CAFs分泌的Annexin A1還能夠促進前列腺癌CSCs的增殖。Cazet等[23]發現，在腫瘤的異種移植實驗中，與單純移植CSCs相比，將CSCs和CAFs共同移植，其成瘤能力顯著增強。此外，CAFs能夠誘導已分化的腫瘤細胞去分化恢復CSCs表型。Vermeulen等[24]研究發現，由于CAFs分泌肝細胞生長因子(HGF),通過作用于酪氨酸激酶受體c-Met激活Wnt信號通路，使位于結腸癌邊緣的腫瘤細胞表達更高的干性特征，導致結腸癌的耐藥及復發。CAFs不僅能夠維持CSCs的干性表型，同時自身高表達ABC轉運蛋白,為CSCs創造相對低藥物濃度的微環境。CAFs還能夠誘導CSCs代謝的改變，影響腫瘤的發生發展。Renner等[25]研究發現，CAF分泌的細胞因子能夠增強CSCs膜上的葡萄糖轉運蛋白的表達，增加細胞對葡萄糖的攝取，供給細胞增殖所需的能量。Su等[26]發現在乳腺癌中，CAFs通過為CSCs提供適宜的微環境，促進腫瘤發展及耐藥。通過靶向根除CAFs，破壞CSCs賴以生存的微環境，可以阻礙乳腺癌的發展，恢復對化療藥物的敏感性。因此，靶向作用于CAFs可以作為一種有效的治療策略。

2.3 慢性炎癥 雖然早期的炎癥反應能夠聯合機體的免疫系統抑制腫瘤的形成，慢性炎癥卻是腫瘤擴張的主要誘因。Kim等[27]發現,IL-6作為免疫和炎癥反應的調節劑，可以通過IL-6-JAK1-STAT3信號通路的激活靶向OCT4基因，導致CSCs增殖，誘導非腫瘤細胞轉化為CSCs。慢性炎癥還會造成低氧的環境。Manupati等[28]研究發現，表皮生長因子EGFR通過環氧化酶-2(COX-2)調節乳腺癌CSCs的自我更新。研究[29]表明，慢性炎癥與CSCs相互促進，如核因子κB-(NF-κB-)介導的炎癥反應增加了腫瘤細胞的干性，而CSCs表達NF-κB-的水平升高，進一步促進炎癥的形成。最新的研究[25,30]表明，腫瘤細胞免疫逃避和糖代謝增強是相互關聯的，并受腫瘤微環境的調節。癌癥相關的免疫細胞，例如巨噬細胞，由于腫瘤微環境中的缺氧狀態，細胞產生大量的乳酸，而過量的乳酸可以使得MI型的巨噬細胞轉化為M2型的巨噬細胞，M2型的巨噬細胞可以分泌TGF-β1、EGF等細胞因子，誘導CSCs的增殖，增強CSCs的侵襲轉移能力，進一步促進腫瘤的發生發展。因此抗腫瘤治療中輔以抗炎治療，可以打破CSCs依賴的生存條件。

綜上所述，細胞周期阻滯、DNA損傷耐受及DNA損傷修復、藥物外排、EMT等CSCs的生物學特性，低氧環境、CAFs、慢性炎癥等腫瘤微環境的特點，共同維持CSCs的干性特征,抑制化療藥物對CSCs的刺激作用，加大了腫瘤治療的困難性。通過對CSCs耐藥機制的研究可以指導開發新的針對CSCs的靶向治療，聯合傳統的治療策略，同時消除CSCs和腫瘤細胞，提高腫瘤的治療效果。