食品中大腸埃希氏菌O26血清型檢測方法的建立

丁 琦，林偉新,蔡教英，林國生，王小玉，游淑珠，陳俊言，許喜林

(1.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州 510640;2.珠海出入境檢驗檢疫局,珠海 519000)

大腸埃希氏菌(DiarrheagenicEscherichiacoli)是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的細菌，可經過污染食物引起人類發病。常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、產腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、產志賀毒素大腸埃希氏菌(包括腸道出血性大腸埃希氏菌，STEC/EHEC)和腸道集聚性大腸埃希氏菌(EAEC)，雖然類別多樣，但都是能夠通過傳播導致人畜共患病的病原菌[1-2]。據統計，美國近年來除腸道出血性大腸埃希氏菌O157外引起的食源性疾病致病病例中，有71%是由O26、O45、O103、O111、O121和O145血清型所致[3]，其中O26的報道較多。腸道出血性大腸埃希氏菌 O26現已經逐漸成為美國、加拿大、澳大利亞及部分歐盟發達國家引起人類食源性疾病的主要病原菌[4-8]。因此，快速檢測和鑒別食品中腸道出血性大腸埃希氏菌O26是保障食品質量安全和防止食源性疾病暴發的有效手段。本文主要應用PCR方法，通過設計引物，優化反應條件，建立食品中大腸埃希氏菌O26血清型的PCR檢測方法，以便對其進行快速、準確的檢測，并有利于克服傳統分離鑒定方法耗時費力、步驟繁瑣等不足之處。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

目標菌株：大腸埃希氏菌ATCC 12795。非目標菌株：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2469、大腸埃希氏菌ATCC 23982、大腸埃希氏菌ATCC 35150、大腸埃希氏菌CCTCC AB 200051、大腸埃希氏菌EHEC Stx1、大腸埃希氏菌EHEC Stx2、大腸埃希氏菌NCTC 12900、大腸埃希氏菌EC O104、大腸埃希氏菌ATCC 43887、大腸埃希氏菌ATCC 29552、大腸埃希氏菌ATCC 33780、大腸埃希氏菌ATCC BAA-2190。

1.1.2 主要試劑

營養肉湯(廣州環凱)；腸道菌增菌肉湯(北京路橋)；DNA 提取試劑盒(Tiangen公司)；PCR反應預混液、DNA Marker DL2000(TAKARA公司)；引物(Invitrogen 公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02 (天根生化科技有限公司)；瓊脂糖H(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Premix ExTaq2× (大連寶生物公司)。

1.1.3 主要儀器設備

培養箱(BINDER)；高壓滅菌鍋(HIRAYAMA)；超低溫冰箱(Thermo)；超微量分光光度計(Thermo)；高速離心機(艾本德)；梯度PCR儀(艾本德)；電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像系統(Alpha Innotech)。

1.1.4 PCR引物序列

表1 引物序列與相關參數Table 1 Sequences and parameters of the primers

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取、濃度及純度的測定

采用DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA，按照試劑盒提供的說明書進行操作。使用超微量分光光度計測DNA的濃度。

1.2.2 PCR反應的建立

反應體系：Premix ExTaq(2×) 12.5 μL，引物對工作液1 μL，加DNA模板2 μL，加ddH2O 9.5 μL至25 μL。反應條件如下：94℃預變性5 min；94℃變性20 s，72℃延伸1 min。我們分別對影響PCR擴增的循環數、引物濃度、退火溫度等因素進行探究和優化，以先確定退火時間、退火溫度，最后確定循環數的順序探究。退火時間梯度為30、60、90 s；退火溫度梯度為55.2℃、55.8℃、56.7℃、57.8℃、59.1℃、60.4℃、61.7℃、62.9℃、63.9℃及64.6℃；循環數為30、35和40個，分別在不同的退火溫度下同時擴增各目標片段。5 V/cm恒壓電泳30 min，用凝膠成像分析系統進行分析。

1.2.3 特異性試驗

將目標菌株和非目標菌株的DNA作為模板，采用優化好的反應體系和反應條件進行PCR檢測，以評價引物的特異性。

1.2.4 靈敏度試驗

將經提取的模板DNA，用核酸蛋白分析儀測定其核酸濃度，按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8稀釋成濃度梯度，每個稀釋度分別吸取2 μL用于PCR實驗，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對照，采用優化好的反應體系和反應條件進行PCR檢測，以確定其靈敏度。

2 結果與分析

2.1 PCR反應體系的建立

2.1.1 退火時間的優化

從圖1可以看出，在30、60和90 s 3個退火時間都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶；退火時間為90 s的擴增條帶有點拖尾，30 s條帶稍亮于60 s條帶。在沒有明顯差異時，考慮到退火時間短可以降低非特異性擴增概率，同時考慮檢測的快捷原則，所以選擇30 s作為PCR反應的退火時間。

M：DL2000 Marker ；1～2：退火時間30 s；3～4：退火時間60 s；5～6：退火時間90 s

圖1退火溫度對單重PCR的影響
Figure 1 The effect of annealing temperature on PCR

2.1.2 退火溫度的優化

從圖2可以得知，在10個退火溫度梯度都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶?？紤]到退火溫度在亮度無明顯差異時選擇較高溫度可以避免非特異性結合，選擇60.4℃作為PCR反應條件的退火溫度。

M：2000 bp Marker；O26退火溫度，1～10分別為55.2℃、55.8℃、56.7℃、57.8℃、59.1℃、60.4℃、61.7℃、62.9℃、63.9℃和64.6℃

圖2退火溫度對單重PCR的影響
Figure 2 The effect of annealing temperature on PCR

2.1.3 循環數的摸索

從圖3可以得知，O26菌株在30、35、40這3種循環數下擴增都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶；所以我們選擇35個循環作為單重PCR的反應條件。

M：2000 bp Marker；O26循環數，1～2為30個循環；3～4為35個循環；5～6為40個循環

圖3循環數對PCR的影響
Figure 3 The effect of recurring number on PCR

綜上所述，確定PCR體系：Premix ExTaq2×12.5 μL ，引物對工作液1 μL，加DNA模板2 μL，加ddH2O補至25 μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性20 s ，60.4℃退火30 s，35個循環；72℃延伸1 min。

2.2 特異性試驗

將所有菌株的DNA分別吸取2 μL用于PCR實驗，在同一反應體系中加入大腸埃希氏菌ATCC 12795核酸模板1 μL作為陽性對照，采用優化好的反應體系和反應條件進行PCR檢測O26血清型特異基因，以確定其特異性，所有菌株擴增結果與預期結果完全一致，擴增電泳圖如圖4。

M：DNA Marker DL2000；1：大腸埃希氏菌ATCC 12795；2：大腸埃希氏菌ATCC 12795；3：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2469；4：大腸埃希氏菌ATCC 23982；5：大腸埃希氏菌ATCC 35150；6：大腸埃希氏菌CCTCC AB 200051；7：大腸埃希氏菌EHEC Stx1；8：大腸埃希氏菌EHEC Stx2；9：大腸埃希氏菌NCTC 12900；10：大腸埃希氏菌EC O104；11：大腸埃希氏菌ATCC 43887；12：大腸埃希氏菌ATCC 29552；13：大腸埃希氏菌ATCC 33780；14：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2190

圖4 PCR特異性試驗
Figure 4 Specificity test of PCR reaction

2.3 靈敏度試驗

將濃度為100 ng/μL的核酸逐步進行10倍稀釋后分別進行PCR反應通過試驗發現，核酸經過10-8倍稀釋后，普通PCR 產物經過瓊脂糖電泳染色后能觀測到1 pg/μL濃度的條帶，結果見圖5。這說明該反應的靈敏度能達到1 pg/μL。

M：DNA Marker DL2000；1～9：大腸埃希氏菌ATCC 12795核酸100～10-8稀釋物各2 μL

圖5擴增靈敏度試驗
Figure 5 sensitivity test of PCR reaction

2.4 樣品加標試驗

將新鮮培養的目標菌制成約0.35 McF濃度的菌懸液，10倍遞增稀釋至10-7稀釋度，此時樣品菌懸液濃度為10 CFU/mL的菌懸液用于樣品加標試驗。無菌取25 g食品樣品至225 mL EC肉湯，分別添加對應目標菌株10 CFU/mL的菌懸液1 mL加至食品樣品肉湯制備成10 CFU/25 g的加標樣品，拍擊式均質器均質2 min。將上述EC肉湯置36℃增菌24 h，分別采用普通PCR進行檢測。各濃度添加樣品試驗結果與預期一致，其檢測靈敏度可達10 CFU/25 g。

3 討論

目前對于食品中大腸埃希氏菌的檢測，基本上采用的是傳統的微生物培養方法，檢驗步驟繁雜，周期長[9]。而PCR比傳統微生物檢驗更快速，比核酸探針檢測法更廉價。本研究建立的方法比特異性高，靈敏度高，適用于臨床診斷、食品衛生監控及進出口食品安全檢測，具有較強的實際應用價值，可推廣使用。根據實驗結果發現，使用該引物可以對大腸埃希氏菌O26進行特異性擴增以達到檢測目的。大腸桿菌作為較常見的污染致病菌，雖然國內外都有使用PCR檢測大腸桿菌的相關研究，但大多是檢測大腸桿菌O157：H7，并且多與沙門氏菌、金黃色葡萄球菌聯同檢測[10]。近兩年國外有少量以大腸埃希氏菌O26為對象的研究[11-13]，國內針對大腸埃希氏菌O26的研究較少，這也就是本論文研究的必要性。通過本文的實驗數據，一方面可以豐富大腸埃希氏菌主干研究內容，為其檢測和應用提供可能性；另一方面可以為食源性污染提供快速檢測方法，降低生活中食源性疾病暴發的可能性。