一種紅棕色真菌色素穩定性的初步研究

陳 鑫，楊解解，薛鵬飛，劉俊林

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124）

枸杞（Lycium chincnse Mill）是我國藥食同源，歷史悠久的名貴中藥材?，F代藥理研究發現枸杞具有多種活性，包括滋補肝腎，預防腫瘤及動脈粥樣硬化等重要藥用功效[1]。內生真菌是一類長期潛伏于植物體內而不引起植物明顯不適的微生物，內生真菌與植物的共生關系使內生真菌能在植物體內產生豐富的次生代謝產物，為色素的開發利用提供了一種新的研究思路[2]。

天然色素有很高的營養價值和藥理功能等優越性，且相比于其他色素安全性較高，日益受到重視和青睞。真菌色素是微生物色素中研究和應用最多的一類色素，特別是某些絲狀真菌是天然色素的重要來源[3]。但天然色素一般穩定性較差，對光、熱、金屬離子、pH、氧化劑等因素非常敏感，色價會隨著環境條件的變化而發生改變[4]，色素的穩定性決定了其應用范圍，可見色素穩定性的研究具有非常重要的意義。本試驗通過組織塊法、平板劃線法從中藥材枸杞中分離純化得到1株產紅棕色素的菌株（GQ-16-1）[5]，采用固體培養，萃取，離心提取色素，采用比色法、單因子研究法從酸堿度、溫度、金屬離子及氧化劑等方面初步探究枸杞內生真菌GQ-16-1所產紅棕色素的穩定性[6-9]，旨在為該色素的分離，純化、鑒定與利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 枸杞內生真菌菌株GQ-16-1。由西北民族大學生命科學與工程學院細胞與胚胎工程實驗室、生化與生物制藥實驗室共同分離、保藏的中藥材枸杞內生真菌菌株GQ-16-1。

1.1.2 PDA固體培養基。馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g，定容至1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 紅棕色素提取與精制。純化菌株，制備真菌GQ-16-1懸液并涂布接種于固體PDA培養基，28℃恒溫培養至培養基中色素含量飽和，分離菌絲與培養基，棄菌絲保留含色素的培養基，將含有色素的培養基搗碎并浸泡于色素溶解劑（經試驗，該真菌色素易溶于水）中，料液比為質量/體積=1/40，振蕩過夜，離心，得到色素溶液，將色素溶液真空冷凍干燥得到干品色素，4℃保藏。

1.2.2 紅棕色素測試溶液配制。將干品色素溶于蒸餾水中，精確制成濃度為0.001g/mL的測試用色素溶液。

1.2.3 紅棕色素的光譜特性。以溶劑為空白對照，先用紫外可見分光光度計在300nm、350nm、400nm、450nm、500nm、550nm、600nm、650nm、700nm、750nm、800nm波長下對色素測試溶液進行掃描，測定一個范圍，再減小波長組距精確掃描，觀察其吸收光譜特性，確定其最大吸收波長λmax。

1.2.4 pH值對色素穩定性的影響。用蒸餾水、NaOH、HCl配置 pH 值分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的酸堿試驗試劑，分別加入色素測試溶液中（色素測試溶液與酸堿實驗試劑的比值為3∶1），搖勻。將色素測試溶液與蒸餾水按3∶1混合做對照，靜置2h，觀察并記錄，在最大吸收波長下分別測定不同pH值條件下色素溶液的吸光度。

1.2.5 溫度對色素穩定性的影響。取9支試管分別加入5mL 色素測試溶液，標記編號 1、2、3、4、5、6、7、8、9，分別放置于 20、30、40、50、60、70、80、90 和 100℃水浴條件下加熱30min，觀察并記錄溶液顏色，在最大吸收波長下分別測定不同溫度條件下色素溶液的吸光度。

1.2.6 金屬離子對色素穩定性的影響。將含有金屬離子的鹽類（CaSO4、K2CrO7、Na2CrO7、BaSO4、Al2（SO4）3、Cu-SO4、FeCl3、FeCl2、MgCl2）配制成金屬離子濃度為0.2mg/mL的金屬離子實驗試劑。分別把色素測試溶液與各金屬離子實驗試劑混合搖勻（色素測試溶液與金屬離子實驗試劑的比值為3∶1），將色素測試溶液與蒸餾水按3∶1混合做對照，靜置2h，觀察并記錄，在最大吸收波長下分別測定不同金屬離子條件下色素溶液的吸光度。

1.2.7 氧化劑對色素穩定性的影響。將具有氧化性的鹽類（K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、濃 H2SO4、濃 HCl、濃 HNO3、K2MnO4，NaClO）配置成濃度為0.2mg/mL的氧化劑實驗試劑。分別把色素測試溶液與各氧化劑實驗試劑混合搖勻（色素測試溶液與氧化劑實驗試劑的比值為3∶1），將色素測試溶液與蒸餾水按3∶1混合做對照，靜置2h，觀察并記錄，在最大吸收波長下分別測定不同氧化劑條件下色素溶液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 真菌菌株固體培養和紅棕色素測試溶液圖

枸杞內生真菌菌株GQ-16-1在接種的第3天開始產生紅棕色色素，第10天色素達到飽和。圖1中真菌GQ-16-1已培養至第10天，色素含量達飽和，圖2為采用固液萃取，離心提取色素，真空冷凍干燥的提取工藝得到的色素配制而成的色素測試溶液，該色素極易溶于水，其水溶液澄清透明，色澤鮮艷。

圖1 真菌菌株固體培養圖

圖2 紅棕色素測試溶液圖

2.2 紅棕色素的光譜特性

圖3表明，該紅棕色素測試溶液在波長350nm處有最大吸收峰，其吸光度值為1.670。

圖3 色素特征吸收光譜曲線

圖4 pH值對色素穩定性影響

2.3 pH值對色素穩定性的影響

pH值對紅棕色素穩定性的影響結果如圖4所示，該圖表明在pH值2～8之間，最大吸收波長下測得的吸光度值上下波動，變化不明顯。在pH值9～10之間，色素測定溶液的吸光度值有所增加，溶液顏色加深?？傮w來說，紅棕色素對pH變化不敏感。

2.4 溫度對色素穩定性的影響

由圖5可知，在20～100℃之間，吸光度值上下波動，變化不明顯?？傮w來看，試驗認為該紅棕色素對溫度變化不敏感。

圖5 溫度對色素穩定性影響

2.5 金屬離子對色素穩定性的影響

圖6 金屬離子對色素穩定性影響

由圖6可知，Al3+存在條件下，吸光度值下降，表明Al3+對該紅棕色素有明顯不良影響。因此，該色素在生產、運輸、存儲過程中應避免與鋁制品接觸，也可以添加一些螯合劑如EDTA等來消除金屬離子的影響。而Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ba2+、K+（只含 1 種金屬離子）存在條件下，其吸光度值上下波動，無明顯變化，對色素穩定性無顯著影響。

2.6 氧化劑對色素穩定性的影響

圖7 氧化劑對色素穩定性影響

圖7表明，強氧化劑NaClO對紅棕色素測試溶液有明顯增色效果，且無沉淀產生，因此在非食品應用的實際生產中可適量添加NaClO來增加該紅棕色素的色澤。而K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、濃H2SOA、濃HCl、濃HNO3、K2MnO4（只含1種氧化劑）存在條件下，其吸光度值上下波動，對紅棕色素穩定性無顯著影響。

3 結論與討論

通過對枸杞內生真菌GQ-16-1所產紅棕色素的初步研究，發現該紅棕色素為水溶性，最大吸光值出現在350nm處，吸光度值為1.670。在pH值2～10穩定，偏堿性顏色加深。在溫度為20～100℃穩定，說明該色素適用范圍廣，不受溫度限制。金屬離子Ca2+、Na+、Cu2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ba2+、K+（只含1種金屬離子）對色素穩定性基本無影響，Al3+對色素穩定性有不良影響，因此該色素在應用、制備與保存時都應避免與鋁制品接觸。強氧化劑NaClO對其有明顯增色效果，在K2CrO7、Na2CrO7、FeCl3、濃 H2SO4、濃 HCl、濃 HNO3、K2MnO4（只含1種氧化劑）中穩定存在。

真菌作為一種重要的色素產生菌，在其他研究中早有報道[10]，如鏈霉菌、三孢布拉霉菌、產紫青霉等，本試驗發現的這株產紅棕色素菌株是對產色素菌的進一步豐富。試驗采用固液萃取，離心提取色素，真空冷凍干燥的提取工藝，不僅簡單易操作，而且提取效率高，不易對色素本身品質造成損害。且溶劑為水，降低成本的同時也不易造成環境污染。采用比色法，單因子研究法測試該色素穩定性時，肉眼所見顏色無明顯變化并且吸光度值變化不大則認為對該色素穩定性無影響。在研究金屬離子對色素穩定性的影響時，實驗試劑用鹽類配制，含有其他離子，因此理論上存在誤差。真菌色素使用的最大障礙是毒素的檢測，而本研究未對色素進行毒理性研究，因此其安全性研究還需進一步開展。另外，還需研究該色素提取工藝的優化及菌株生長條件的優化，使其能盡早應用于生產。此外，本研究只對色素穩定性進行了初步研究，該色素的生物學活性方面有待深入研究，為開發抗氧化、抑菌、保健等功能色素奠定基礎，提升其應用價值。