自噬在肺纖維化中的作用機制

歐文芳，劉 剛，王亞紅，宋澤慶

(廣東醫科大學附屬醫院a.臨床醫學研究中心，b.呼吸內科，廣東 湛江 524001)

肺纖維化是一種慢性、漸進性的肺間質性疾病，由持續的肺泡上皮細胞損傷和病理性損傷修復所致，可通過影響肺換氣導致嚴重的肺功能障礙，從而引起致命性的后果。臨床上，肺纖維化多表現為進行性呼吸困難伴有刺激性干咳，病情呈進行性發展，患者最終因呼吸衰竭而死亡。肺纖維化患者的中位生存時間一般為3年[1]。肺移植曾是提高其患者生存率的唯一方法，近年美國食品藥品管理局批準了兩種藥物用于治療特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)，分別為尼達尼布和吡非尼酮，但其確切作用機制尚未完全明確[1]。雖然已有病理學研究證實了部分參與發病進程的相關機制，但IPF的發病機制仍不清晰。隨著研究的不斷深入，發現自噬功能障礙在肺纖維化發生發展中起重要作用，其通過參與成纖維細胞活化、肌成纖維細胞分化和細胞外基質(extracellular matrix,ECM)沉積等途徑促進肺纖維化，提示自噬可能是肺纖維化發病的重要機制之一[2]，而靶向調控自噬有望為肺纖維化的診療提供新靶點?，F就自噬在肺纖維化中的研究進展予以綜述，旨在闡明自噬在肺纖維化中的作用機制。

1 自 噬

自噬是細胞自身降解陳舊蛋白、細胞器，回收利用氨基酸、核酸等小分子以實現自身代謝需要和特定細胞器更新的過程。在哺乳動物細胞中，其信號調控主要通過依賴哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和不依賴mTOR途徑。其中，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/mTOR信號通路是調節細胞生長、增殖、運動和存活的核心途徑[3]。研究發現，細胞在饑餓、缺氧、氧化應激、病原體感染、輻射和藥物等應激情況下，自噬水平升高[4]。

自噬主要分為微自噬、巨自噬和伴侶介導的自噬3種類型，雖然三者在形態學上互不相同，但最終均是將內容物運送到溶酶體中進行降解和再循環，其中巨自噬的研究最為廣泛。在生理條件下，巨自噬以低水平發生，其通過降解受損或多余的細胞器以維持細胞生長。在應激條件下，自噬被誘導活化并通過降解胞內代謝物促進物質合成或能量產生，從而保證細胞存活[4]。雖然巨自噬是一種細胞保護機制，但過度的自我降解是有害的。因此，自噬功能障礙與多種人類疾病有關，包括肺纖維化、神經變性、癌癥、衰老等。

巨自噬又分為非特異性巨自噬和選擇性巨自噬。在營養或能量匱乏的情況下，非特異性巨自噬可促進細胞存活，而選擇性巨自噬具有高度特異性，在維持細胞穩態中起重要作用。線粒體自噬是一種對線粒體進行降解的選擇性巨自噬，對細胞的穩態更新和特定細胞的發育、自我清除起重要作用[3]。其是一種針對線粒體更新，調節線粒體數量與細胞能量需求匹配，并清除受損和功能失調的線粒體的選擇性和適應性反應。如在哺乳動物中，紅細胞的成熟是通過線粒體自噬清除未成熟紅細胞中的線粒體而實現[3]。目前，線粒體自噬主要有以下兩種途徑：①紅細胞的成熟是通過BNIP3L(Bcl-2/E1B 19 kDa-interacting protein 3-like)-微管相關蛋白1輕鏈3(microtubules associated protein 1 light chain 3，LC3)相互作用識別自身線粒體而達到清除線粒體的目的；②在清除受損線粒體時，PARK(Parkin)2通過與線粒體膜上的PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)結合，對線粒體外膜蛋白進行泛素化，使其與LC3相互作用的受體SQSTM1(sequestosome-1)/p62結合而達到清除線粒體的目的。雖然兩種途徑最終均與LC3相互作用導致線粒體降解[3]，但目前關于線粒體自噬的機制仍未完全清晰。無論是從代謝、活性氧類產生，還是線粒體DNA損傷累積方面，線粒體損傷均會導致細胞損傷和凋亡[5]。因此，線粒體自噬是維持細胞完整性和正常生理功能的重要過程。

2 自噬在肺纖維化中的作用

有學者發現，IPF患者的肺組織表現為p62和自噬體數目增加[2,6]，而在成纖維細胞灶內mTOR活性較高，LC3B的表達減少[7]，說明自噬參與了肺纖維化的發展。研究發現，用促纖維化因子白細胞介素-17處理肺上皮細胞可減少自噬相關重要基因的表達，包括Beclin1、自噬相關基因(autophagy related genes,Atg)14[8]。因此，自噬功能障礙被認為在肺纖維化發生發展中發揮了作用。

2.1調控ECM的沉積 肌成纖維細胞過度表達α平滑肌肌動蛋白并促進ECM沉積，進而導致肺纖維化。在IPF患者肺分離的成纖維細胞中，LC3B水平降低，磷酸化Akt和磷酸化mTOR增加[7]。研究發現，在肺成纖維細胞中，通過敲除LC3B和Atg5基因抑制自噬可以誘導肌成纖維細胞分化，并使α平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白表達增加，其與轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導的纖維化效果一致[2]，說明抑制自噬的活化可誘導肌成纖維細胞分化，促進ECM沉積。Atg4b缺陷小鼠在博來霉素處理后炎癥反應加劇，并導致肺組織廣泛纖維化和膠原沉積[9]，提示自噬不足可誘導膠原沉積。Nho和Hergert[7]發現，肺纖維化中病理性肌成纖維細胞表型ECM的分泌能力更強。當正常成纖維細胞受到大量的膠原聚合刺激時，自噬被激活；然而，IPF患者肺中的肌成纖維細胞沒有這種應激反應[7]。進一步研究發現，在IPF患者肺成纖維細胞中叉頭框蛋白(forkhead box protein,FOX)O3a信使RNA和蛋白水平明顯降低，而FOXO3a是蛋白激酶B的下游靶標且涉及自噬的轉錄激活，因此在膠原富集的過程中,FOXO3a的表達下調使LC3B信使RNA水平也明顯降低[10]，表明通過抑制FOXO3a來抑制自噬可促進肺纖維化[11]。此外，雷帕霉素也可抑制肌成纖維細胞中α平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白的表達[6]?？梢?，自噬可調控肺纖維化ECM沉積進程，但其在ECM沉積中的具體分子機制尚不明確，有待進一步研究。

2.2緩解肺上皮細胞功能障礙 上皮細胞是肺組織的重要屏障，既能分泌抗纖維化、抗炎介質[12]，也能分泌促纖維化因子，在肺纖維化的形成中起關鍵作用[13-14]。有假說認為，上皮細胞應激導致慢性或持續性肺損傷，進而促進纖維化[15]。因此，有關自噬在上皮細胞中的表現與纖維化的關系成為研究熱點。在肺表面活性蛋白(SPC或SPA)基因突變或Hermansky-Pudlak綜合征相關肺間質性疾病中，突變蛋白錯誤折疊后在上皮細胞內大量積累，可導致細胞應激和纖維化[16]。這種突變蛋白的過度表達導致自噬流阻滯，線粒體自噬減少，從而破壞胞內蛋白平衡，且攜帶這種突變蛋白的患者處理繼發性肺損傷的能力會降低，故使得上皮細胞更容易受到損傷并發生纖維化。此外，在Hermansky-Pudlak綜合征患者的上皮細胞及Hermansky-Pudlak綜合征基因突變小鼠中也可以觀察到自噬功能障礙。另有報道，A549細胞中的Hermansky-Pudlak1基因敲除導致LC3B減少和p62累積，而過表達LC3B能恢復自噬功能并減少p62的累積[17]。條件性敲除小鼠上皮細胞中的結節硬化復合物1基因，使得博來霉素誘導的小鼠更容易發生肺纖維化，而通過雷帕霉素活化自噬后，這種情況可以逆轉[18]。故認為，自噬不足導致上皮細胞功能障礙繼而促進肺纖維化，而激活自噬可增強上皮細胞修復能力，延緩肺纖維化。但自噬是如何調控并影響上皮細胞功能的分子機制仍不清楚，有待進一步研究探討。

2.3參與上皮間質轉化 上皮間質轉化是一個上皮細胞表型轉換分化為間質細胞的過程，這在肺纖維化的形成過程中起重要作用。在內皮細胞中，Atg7功能喪失導致TGF-β上調并促進內皮細胞間質轉化，這種情況較博來霉素誘導的肺纖維化更嚴重[15]。研究發現，瘦素通過PI3K/Akt/mTOR途徑抑制A549細胞的自噬，從而加速其上皮間質轉化進程[19]。以上研究表明，抑制自噬活化能有效誘導上皮細胞分化，進而加速上皮間質轉化過程。目前，大部分有關上皮間質轉化的研究集中在腫瘤細胞，而相關研究表明肺纖維化的發生與腫瘤部分通路發生相似[20-23]，故有關上皮間質轉化與肺纖維化的關系有待進一步探討。

2.4減少細胞凋亡 據報道，在IPF中成纖維細胞和肌成纖維細胞具有高度的抗凋亡活性[24]。在IPF患者的肺成纖維細胞中，Beclin1的表達下調，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加[20]。自噬相關基因Atg4b缺陷小鼠在用博來霉素處理7 d后，其肺泡和支氣管上皮細胞凋亡增加[9]。同時在IPF患者肺成纖維細胞中也觀察到，當mTOR通路持續激活時，其抗凋亡能力顯著增強[25]，而當FOXO3a和LC3B的表達減少時，Ⅰ型膠原基質誘導的細胞凋亡減少[10]?；謴虵OXO3a或LC3B的表達后，成纖維細胞對膠原基質誘導的細胞凋亡恢復敏感[10]。Nho和Hergert[7]發現，異常激活的人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/Akt/mTOR信號通路可誘導肌成纖維細胞在膠原合成上發生自噬，從而使細胞存活。因此，自噬可通過mTOR通路減少成纖維細胞凋亡，從而增加其抗凋亡能力。目前，關于自噬如何參與凋亡的機制仍不明確，需進一步探討。

2.5協同TGF-β1信號通路 TGF-β是肺纖維化的主要調節因子之一[26]，而許多自噬基因(Atg4c、Atg5、Atg7、Atg16l1、Atg16l2、氨基丁酸受體相關蛋白、PARK、PINK1、p62和泛素樣激酶2)與TGF-β的調控相關[27]。TGF-β1通過調節肌成纖維細胞的分化和增殖，促進ECM沉積，其被認為是肺纖維化發展的關鍵因素之一[28]；同時，它可以抑制成纖維細胞中的自噬[27]。此外，TGF-β能誘導MRC-5細胞分化，并增加纖連蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和α平滑肌肌動蛋白的表達，激活mTOR通路，減少LC3B和增加p62的表達[6]。Tubastatin可通過抑制TGF-β誘導的PI3K-Akt-低氧誘導因子-1α-血管內皮生長因子途徑減少自噬發生，抑制膠原蛋白的沉積[29]。而敲減Beclin1或LC3使得TGF-β誘導的肌成纖維細胞分化增強，纖連蛋白和α平滑肌肌動蛋白蛋白表達水平上調更為明顯[6]。相反，雷帕霉素能減弱TGF-β誘導的肌成纖維細胞分化[6]。干擾真核生物延伸因子2激酶表達后，mTOR信號通路被激活，TGF-β1對自噬的影響增強，LC3B蛋白減少，p62蛋白水平升高。而雷帕霉素可以逆轉TGF-β對真核生物延伸因子2激酶缺陷的成纖維細胞作用[30]。沉默LC3和Atg5基因增加了α平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達，且TGF-β處理能進一步升高它們的表達水平[2]。目前，關于TGF-β1介導的相關信號通路如何協同自噬參與肺纖維化發病的機制尚存在爭議，需進一步探討。

2.6介導內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS) ERS是肺纖維化發病的重要機制之一，能夠有效誘導自噬激活。其主要通過PERK-eIF2α-ATF4-CHOP級聯激活自噬基因轉錄，并通過IRE1-c-Jun氨基端激酶介導Bcl-2的磷酸化，使Beclin1與Bcl-2解離，從而活化Vps34促進自噬體形成[1,31]。Araya等[2]在人支氣管上皮細胞中使用Torin1(mTORC1/2抑制劑)或沉默LC3或Atg5基因可加劇ERS，從而誘導細胞衰老。Bueno等[32]用衣霉素(ERS誘導劑)誘導A549細胞ERS，導致線粒體去極化和細胞凋亡；當使用巴弗洛霉素A1抑制自噬時加劇了線粒體去極化和細胞凋亡，說明自噬不足會加劇ERS破壞線粒體的穩態。在小鼠體內，通過氣管內注射衣霉素或感染鼠皰疹病毒68(與EB病毒同源)可引起體內ERS和PINK1的表達下調，從而發生肺纖維化；但敲除PINK1小鼠肺中的p62表達增加，纖維化加重[32]。Bueno等[33]還發現隨著年齡增加，持續的ERS會減少PINK1的表達，且在肺泡上皮細胞中ERS可誘導PINK1的轉錄抑制因子活化轉錄因子3的表達，從而抑制自噬。目前，關于ERS如何介導自噬調控肺纖維化的機制尚未完全清楚，需要進一步研究。

2.7調節血管緊張素(angiotensin，Ang) 腎素-Ang系統在肺纖維化的發病機制中發揮了重要作用[34-35]。腎素-Ang系統包括血管緊張素轉換酶/AngⅡ/AngⅡ-1型受體和血管緊張素轉換酶2/Ang-(1～7)/Max兩大軸系。AngⅡ通過其特異性受體AngⅡ-1型受體參與肺部多種疾病的發生發展，而Ang-(1～7)通過作用于其特異性受體Max發揮對AngⅡ的拮抗作用。AngⅡ在肺纖維化中是誘導膠原合成、自噬發生和膠原降解的關鍵因子。Meng等[36]發現，自噬通過氧化還原調節AngⅡ引起的活性氧增加和核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3炎癥小體激活過程，從而減輕肺纖維化。而Ang-(1～7)可減弱活性氧引起自噬受損，改善與吸煙相關的肺纖維化[37]。此外，過表達血管緊張素轉換酶2可以增強自噬，改善肺部膠原的沉積[38]。目前，關于Ang如何協調自噬參與IPF發生、發展的報道甚少，有待進一步研究。

2.8指導肺纖維化的臨床用藥 在臨床用藥中，美國食品藥品管理局批準了兩種用于治療IPF的藥物，分別是吡非尼酮和尼達尼布。已有報道，敲減Atg5和Atg7基因明顯抑制了吡非尼酮誘導的自噬，表明吡非尼酮可以激活經典的自噬途徑[39]。PARK2介導的線粒體自噬在肺纖維化中起調節肌成纖維細胞分化的作用[40]，吡非尼酮可通過PARK2促進LC3的轉化誘導自噬，從而調節肌成纖維細胞分化。但是，吡非尼酮的抗纖維化功能主要通過抗氧化作用實現，敲除PARK2基因可使血小板衍生生長因子受體-PI3K-Akt信號轉導衰減，而吡非尼酮抗氧化活性并不完全依賴于PARK2介導的線粒體自噬，故證明吡非尼酮可部分通過自噬激活參與肺纖維化進程[39]。而尼達尼布可以激活非經典自噬途徑，下調IPF中成纖維細胞的ECM生成能力，減少纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達，并抑制原代人成纖維細胞中TGF-β相關通路的激活[41]。因此，治療肺纖維化藥物的作用機制與自噬密切相關，它們通過促進自噬改善肺纖維化。

3 小 結

目前，雖然有不少獲批上市的治療肺纖維化藥物，但其確切作用機制仍不完全清楚，因此亟須闡明新的IPF發病機制和尋找更有效的藥物靶點阻斷肺纖維化的發生發展。自噬作為細胞的保護機制，不僅參與了氨基酸供應，還參與了各種細胞應激反應，對維持細胞穩態和清除有害物質起重要作用。隨著研究的不斷深入，目前大部分證據表明自噬缺陷廣泛存在于ECM富集、肺上皮細胞功能障礙、凋亡、TGF-β信號刺激、ERS、Ang系統等促進肺纖維的發生發展的生物學活動中。因此，自噬有望為IPF的治療提供新靶點和方向。但自噬如何調控其相關通路參與肺纖維化的作用仍存在爭議，需進一步探討。