寵物源大腸桿菌產ESBLs流行性調查與耐藥機制研究

楊守深，王佳慧，林 敏，曾曉菲，邱敏華，陳文燕，何玉琴，林釗盛，林煒明

第三代頭孢菌素具有高效、廣譜、安全等優點是獸醫臨床重要的抗感染藥物。隨著第三代頭孢菌素的廣泛使用，大腸桿菌對此類藥物的耐藥情況日益嚴重。產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)是介導大腸桿菌對第三代頭孢菌素耐藥的重要機制。由于寵物與人類存在密切接觸，兩者之間的耐藥菌可能互相傳播，導致嚴重的公共衛生問題[1]。近年來廣大的科研工作者對細菌耐藥性及傳播機制做了大量的研究，主要集中在食源大腸桿菌，對寵物源大腸桿菌的耐藥性研究相對較少，其中很少有關寵物源產 ESBLs 大腸桿菌的分子流行病學的數據。

本研究對2014年從廣州市動物醫院采集患病犬貓的肛門拭子，分離大腸桿菌，通過測定寵物源大腸桿菌藥物敏感性、ESBLs的流行分布特征、種族系統進化關系、耐藥質粒CTX-M水平傳播性及其基因環境等，為正確評估第三代頭孢菌素在寵物臨床中使用風險性及耐藥基因的傳播擴散。

1 材料與方法

1.1試劑 麥康凱瓊脂、 LB 肉湯、LB 瓊脂、MH 瓊脂及MH肉湯，均購自廣東環凱微生物科技有限公司。rTaq 酶、ExTaq 酶以及DNA 分子量標準購自 TaKaRa 公司。氨芐西林、頭孢噻呋、頭孢噻肟、鏈霉素、慶大霉素、環丙沙星、諾氟沙星、喹乙醇、氯霉素、氟苯尼考、多西環素、黏菌素、磺胺甲噁唑以及甲氧芐啶購自中國獸醫藥品監察所。頭孢他啶、頭孢西丁和阿米卡星購自中國藥品生物制品檢定所。萘啶酸購自浙江國邦藥業有限公司。引物合成和PCR產物序列測定由深圳華大基因股份有限公司完成。

1.2菌株的分離與鑒定 受試菌株為2014年從廣州市4所動物醫院采集犬貓肛門拭子樣品共92份，其中貓源28份，犬源64份。將采集的拭子接種于LB肉湯培養基，震蕩培養12～16 h后，均勻劃線麥康凱瓊脂培養基，過夜培養挑選具有大腸桿菌典型形態的單菌落，再次劃線麥康凱瓊脂培養基進一步純化，最后通過基質輔助激光解析串聯飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)對疑似大腸桿菌菌株進行菌種鑒定。經分離純培養后的大腸桿菌，用終濃度為30%滅菌甘油肉湯保存。

1.3藥物敏感性測定 根據美國臨床實驗室標準化委員會(CLSI，M100-S25)推薦的方法，采用二倍瓊脂稀釋法測定17種臨床常見的抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)，以完全抑制細菌生長的最低濃度為最低抑菌濃度。根據CLSI規定耐藥折點分析受試大腸桿菌的耐藥性情況，其中頭孢噻呋[2]和氟苯尼考[3]的耐藥折點參考文獻報道，恩諾沙星的耐藥折點參考(CLSI，M3-A3)雞大腸桿菌的耐藥折點。根據MIC的測定值，計算每種藥物的MIC50和MIC90。其中大腸桿菌ATCC 25922為質控菌。

1.4種族進化關系分析 采用水煮法提取細菌基因組DNA。根據Clermont等文獻報道[4]，采用PCR方法，以chuA基因、yjaA基因及一個未知 DNA片段TspE4.C2的存在或缺失，對所有大腸桿菌的種族系統進化關系進行分析。

1.5ESBLs耐藥基因的篩選 采用水煮法提取耐頭孢噻肟大腸桿菌(MIC≥4 μg/mL)的DNA，通過PCR對耐藥菌檢測了編碼超廣譜β-內酰胺酶的耐藥基因CTX-M-1G、CTX-M-9G、TEM、OXA以及SHV，其引物序列參考相關文獻報道，見表1。挑取陽性PCR產物送往深圳華大基因股份有限公司進行測序，將測序結果進行NCBI序列比對分析。

表1 基因引物序列及片段長度
Tab.1 Primer sequences of genes and gene length

基因類別基因名稱 引物序列(5′-3′)片段長度/bp超廣譜β-內酰胺酶TEMF: ATAAAATTCTTGAAGACGAAA1080[5]R: GACAGTTACCAATGCTTAATCSHVF: CACTCAAGGATGTATTGTG885[6]R: TTAGCGTTGCCAGTGCTCGOXAF:TGAAGGGTTGGGCGATTT925[7]R: ACCCGGAGCCTCATTAATTGTCTX-M-1GF: CTTCCAGAATAAGGAATCCC949[8]R: CGTCTAAGGCGATAAACAAACTX-M-9GF: GTGACAAAGAGAGTGCAACGG857[6]R: ATGATTCTCGCCGCTGAAGCC種系發育chuAF: GACGAACCAACGGTCAGGAT279[4]R: TGCCGCCAGTACCAAAGACAyjaAF: TGAAGTGTCAGGAGACGCTG211[4]R: ATGGAGAATGCGTTCCTCAACTspE4C2F: GAGTAATGTCGGGGCATTCA152[4]R: CGCGCCAACAAAGTATTACG

注：F，上游引物；R，下游引物

1.6接合轉移實驗 為了研究CTX-M基因的水平傳播情況，對攜帶CTX-M基因的陽性大腸桿菌進行接合轉移試驗。受體菌為E.coliC600(耐受鏈霉素 ≥2 000 μg/mL)。在含頭孢噻肟(2 μg/mL)和鏈霉素(1 000 μg/mL)的雙藥板中篩選攜帶CTX-M基因的疑似接合子，并對接合子進行鑒定。接合子的藥物敏感性測定同原菌MIC測定方法一樣。對接合子中攜帶的質粒進行復制子類型檢測，方法參考文獻報道[9-10]。

2 結 果

2.1菌株分離鑒定 大腸桿菌在麥康凱培養基上為圓形凸起、邊緣整齊深紅色的菌落；在伊紅美藍培養基上是中心為黑色、有金屬光澤的菌落。在革蘭氏染色以及油鏡下觀察，大腸桿菌為紅色短桿菌。從92份樣品中挑選在麥康凱瓊脂培養基上形態符合的單菌落(犬樣品數為64份，貓的樣品數為28分)，共獲得疑似大腸桿菌71株，進一步通過MALDI-TOF MS質譜儀鑒定，確定56株為大腸桿菌，其中43株為犬源，13株為貓源。大腸桿菌總的分離率為60.9%(56/92)，其中犬源和貓源樣品的分離率分別為67.2%(43/64)和46.4%(13/28)。

2.2藥物敏感性測定 分離株對測試藥物表現出較強的耐藥性，結果見圖1和表2。11種抗菌藥物的耐藥率均達到50%以上。對氨芐西林耐藥率最高，達到100%；其次是磺胺甲噁唑/甲氧芐啶和萘啶酸，耐藥率分為89.3%和87.5%；黏菌素耐藥率最低為7.1%。對頭孢菌素類抗菌藥物耐藥程度不一，對第三代頭孢菌素頭孢噻呋和頭孢噻肟較高， 耐藥率分別為57.1%和55.4%，而對頭霉素類頭孢西丁和第三代頭孢菌素頭孢他啶耐藥率較低，分別為16.1%和10.7%。另外，頭孢噻呋和頭孢噻肟的MIC90也較高為256 μg/mL，MIC50分別為16 μg/mL和4 μg/mL，而頭孢他啶的MIC90和MIC50都較低，分別為8 μg/mL和0.125 μg/mL。對3種或者6種以上抗菌藥物耐藥的菌株數分別為55株和47株，分別占分離株的98.2%(55/56)和83.9%(47/56)，多重耐藥較為嚴重。31株對頭孢噻肟耐藥(MIC ≥ 4 μg/mL)，均為多重耐藥，且都是對7種及7種以上抗菌藥物耐藥。

注：CTX，頭孢噻肟；CAZ，頭孢他啶；CIF，頭孢噻呋；FOX，頭孢西??；AMP，氨芐西林；STR，鏈霉素；GEN，慶大霉素；AMK，阿米卡星；NAL，萘啶酸；CIP，環丙沙星；NRO，諾氟沙星；OLA，喹乙醇；CHL，氯霉素；FFC，氟苯尼考；DOX，多西環素；CS，黏菌素E；S/T，磺胺甲噁唑/甲氧芐啶圖1 寵物源大腸桿菌對藥物的耐藥率Fig.1 Resistance rates of pet-originated Escherichia coli for antimicrobials

表2 寵物源大腸桿菌MIC50和MIC90的分布情況
Tab.2 Distribution of the MIC50and MIC90among pet-originatedEscherichiacoli

抗菌藥物CTXCAZCIFFOXAMPSTRGENAMKNALCIPNROOLACHLFFCDOXCSS/TMIC50(μg/mL)40.125168>2562566442568128161616160.5>320MIC90(μg/mL)256825632>256>256>256>256>256128256256256256642>320

2.3種族進化關系分析 對分離的56株寵物源大腸桿菌的種族進化系統關系進行分析，結果顯示主要分布在A組(25/56，44.6%)，其次是B1組，(21/56，37.5%)，B2組(8/56，14.3%)和D組(2/56，3.6%)分布最少。

2.4ESBLs 耐藥基因的篩選結果 在56 株大腸桿菌中有31株耐頭孢噻肟，其中13株檢測到攜帶CTX-M，檢出率為23.2% (13/56)，其中CTX-M-9G和CTX-M-1G分別為8株和5株。本實驗中共檢測到5種不同的亞型，CTX-M-9G中共檢出2種亞型分別是CTX-M-14和CTX-M-65，檢出率均為12.9%(4/31)；CTX-M-1G中最為流行的亞型為CTX-M-55，檢出率為9.7%(3/31)，其次是CTX-M-3和CTX-M-64，檢出率均為3.2%(1/31)。TEM、OXA和SHV型基因未檢出。種族系統進化關系分析顯示，13株攜帶CTX-M的菌株主要分布在B1組(5)，其次是A(4)和B2組(4)，相關實驗結果見表3。

2.5接合試驗結果 對13株攜帶CTX-M基因的菌株進行接合轉移試驗，有7株CTX-M基因成功轉移，另外6株菌中，經過多次嘗試，都未獲得攜帶陽性接合子。藥物敏感性測定結果顯示，7株接合子對頭孢噻呋、頭孢噻肟以及頭孢他啶的MIC較受體菌提高了4～32倍。另外，接合子對鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星、多西環素的MIC值均有不同程度的升高。復制子分型結果顯示，7株接合子都攜帶IncFIB型質粒。

表3 攜帶CTX-M基因大腸桿菌耐藥譜、種系發育背景及亞型流行分布特征
Tab.3 Resistance spectrum, phylogenetic background and distribution characteristics of subtype in CTX-M gene ofEscherichiacolicarrying

序號來源耐藥譜種系發育關系亞型1貓CTX、CIF、AMP、STR、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、DOX、S/TACTX-M-32狗CTX、CIF、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、FFC、DOX、S/TB1CTX-M-553貓CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、S/TB2CTX-M-554貓CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、S/TB2CTX-M-555狗CTX、CAZ、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、CHL、FFC、DOX、S/TACTX-M-646狗CTX、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、DOX、S/TB1CTX-M-147貓CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、CIP、NRO、FFC、DOX、S/TB2CTX-M-148貓CTX、CIF、AMP、STR、GEN、NAL、CIP、NRO、OLA、FFC、DOX、S/T、CSB2CTX-M-149狗CTX、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、CHL、DOX、S/TB1CTX-M-1410狗CTX、CAZ、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、FFC、DOX、S/TACTX-M-6511狗CTX、CAZ、CIF、AMP、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、CHL、FFC、DOX、S/T、CSACTX-M-6512狗CTX、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、DOX、S/TB1CTX-M-6513狗CTX、CAZ、CIF、AMP、FOX、STR、GEN、AMK、NAL、CIP、NRO、OLA、S/TB1CTX-M-65

3 討 論

本研究調查了廣州市動物醫院寵物源大腸桿菌耐藥情況，結果顯示廣州地區寵物源大腸桿菌耐藥情況較為嚴重，其中氨芐西林、鏈霉素、多西環素、萘啶酸以及復方新諾明等耐藥率達到70%以上；第三代頭孢菌素頭孢噻肟和頭孢噻呋以及氟喹諾酮類藥物環丙沙星和諾氟沙星也呈現較高的耐藥率，均超過55%；對酰胺醇類藥物氯霉素和氟苯尼考耐藥率在50%左右。但是在受試的17種抗菌藥物中，對阿米卡星耐藥率相對較低為33.9%，對頭孢他啶和頭孢西丁的耐藥率不超過20%，對黏菌素的耐藥率最低，僅為7.1%。另外，多重耐藥情況也較為嚴重，對3種或者6種以上抗菌藥物耐藥的菌株分別占98.2%和83.9%。本次藥敏試驗結果與吉林地區寵物源大腸桿菌相比，頭孢噻肟、慶大霉素、環丙沙星等重要的抗菌藥物耐藥率相接近，但是本研究頭孢他啶(10.7%)和阿米卡星(33.9%)的耐藥率明顯低于吉林地區(35.8%，77.6%)，兩地的黏菌素的耐藥率均處于較低水平，耐藥率分別是7.1%和3.9%[11]，但是揚州地區黏菌素的耐藥率卻高達23.5%[12]。鄒夢婷[13]和陳孝杰[14]也測定廣州地區寵物源大腸桿菌耐藥性情況，其中鄒夢婷測定菌株是耐慶大霉素和阿米卡星的腸桿菌，本研究中頭孢噻肟、氨芐西林和氟苯尼考的耐藥率(55.4%、100%、51.8%)與鄒夢婷(55.8%、97.4%、53.3%)相似，其耐藥性都明顯高于陳孝杰的研究結果(25%、80%、27%)。以上的研究結果表明我國寵物源大腸桿菌耐藥情況較為嚴重，對臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的一線藥物，第三代頭孢菌素和氟喹諾酮類藥物耐藥率較高。寵物源大腸桿菌嚴重耐藥性問題，可能與國內寵物行業的發展過程中，抗菌藥的大量、不規范使用密切相關。寵物源大腸桿菌對黏菌素以及頭孢西丁耐藥率較低，可考慮在治療寵物源多重耐藥的大腸桿菌感染性疾病時，可使用這兩種抗菌藥物，但仍需測定菌株的耐藥譜，嚴格控制使用劑量和頻率，減少耐藥性的產生。

第三代頭孢菌素是臨床上治療革蘭氏陰性菌感染的一線抗菌藥物，而ESBLs是介導對第三代頭孢菌素耐藥的主要機制。目前，ESBLs以TEM、SHV、CTX-M和OXA型較為常見，其中，質粒介導的CTX-M 型ESBLs流行性最廣，同時可分為 5個亞群：CTX-M-1G、CTX-M-2G、CTX-M-8G、CTX-M-9G 和CTX-M-25G[15]。本研究在31株耐頭孢噻肟的菌株中只檢測到CTX-M型ESBLs，檢出率為41.9% (13/31)，其亞型以CTX-M-14， CTX-M-65和CTX-M-55為主；未檢測到TEM以及SHV型ESBLs基因，說明還可能存在其他機制降低對三代頭孢菌素的敏感性。2003-2012年從我國患病食品動物源中分離的大腸桿菌中，CTX-M檢測率為20.1%，其中，最為流行的CTX-M亞型為CTX-M-14、CTX-M-55和CTX-M-65[16]。 這表明本研究中CTX-M的流行率高于我國患病食品動物源大腸桿菌中CTX-M的流行率；另外，大腸桿菌中主要流行的CTX-M亞型在我國寵物源中與患病食品動物源中較為一致。在韓國流浪狗和寵物醫院狗腸道樣品大腸桿菌對頭孢噻肟的耐藥率僅為2.9%，其中CTX-M的流行率為1.9%[17]；在美國寵物狗和貓糞便樣品中，只有3%的大腸桿菌分離株產ESBLs，其中CTX-M均屬于CTX-M-1G，主要亞型包括CTX-M-15、CTX-M-14和CTX-M-24；同時還檢測到TEM，SHV 以及OXA-10等編碼ESBLs的基因[18]，而在本研究中僅檢出CTX-M，其他的耐藥基因均未檢出。在歐洲，患病寵物源的腸桿菌中，3.6%的分離株對頭孢噻肟(EUCAST)耐藥，但產ESBLs菌株僅為1.6%，主要產CTX-M酶為主，極少數產TEM酶[19]。這表明我國寵物源大腸桿菌對三代頭孢菌素耐藥率以及CTX-M流行率都遠高于國外，這個可能與我國第三代頭孢菌素廣泛用于人醫臨床以及獸用抗菌藥物頭孢噻呋等廣泛用于動物密有關。另外，我國寵物源大腸桿菌編碼ESBLs的基因主要為CTX-M，很少見TEM，SHV 以及OXA等ESBLs，并且國內外流行的CTX-M亞型也有差異。 這表明我國寵物源大腸桿菌ESBLs基因的流行特征和國外存在一定的差異。

本次分離的大腸桿菌主要分布在A和B1群，即為共生型大腸桿菌。只有少部分的分離株(10/56，17.9%)為B2和D群，與毒力相關；其中4株攜帶CTX-M的大腸桿菌來源于B2群。人醫臨床上介導CTX-M-15基因廣泛傳播的國際流行株ST131大腸桿菌也屬于B2群[20]；在伴侶動物源大腸桿菌中也檢測到攜帶CTX-M-15散播B2-ST131型克隆株[21]。寵物源具有致病性，并攜帶有CTX-M耐藥基因大腸桿菌極有可能通過親密接觸傳給人類，因此，應引起足夠的重視。

對13株攜帶CTX-M菌株進行接合轉移試驗，只有7株菌中CTX-M成功轉移，并獲得7株接合子。比較供體菌、受體菌以及接合子的MIC值發現，接合子對頭孢噻呋、頭孢噻肟、頭孢他啶的MIC值與供體菌相同或相近，較受體菌明顯升高，說明通過質粒在供體菌和受體菌之間發生接合轉移；對氨基糖苷類藥物中的鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星以及四環素類藥物中的多西環素的MIC值均有不同程度的升高，說明介導細菌對于其他藥物耐藥性的基因也隨著質粒的轉移而發生傳遞。7株CTX-M ESBLs接合子中，質粒類型均為IncFIB，屬于IncF群。近年來，許多研究發現復制子類型為IncFIB的質粒經常在大腸桿菌中發現并且非常容易在大腸桿菌之間發生接合轉移，并且CTX-M基因通常位于可接合性IncF質粒上[22]。雖然本研究獲得接合子的復制子類型均為IncFIB，但其耐藥譜不同，表明同一復制子型的質?？蓴y帶不同的基因型。因此應重視對CTX-M酶細菌感染的治療和預防，對防止其他耐藥基因在大腸桿菌中的廣泛傳播擴散具有重要意義。

利益沖突：無