2005年和2015年結核分枝桿菌乙胺丁醇耐藥水平的變化

文舒安，張婷婷，霍鳳敏，尚媛媛，梁 倩，薛 毅，李云絮，王 芬，逄 宇，黃海榮

結核病是全球十大死因之一，是高于包括艾滋病在內的傳染病的頭號殺手，2016年全球約有167萬人死于結核病。據WHO《2016全球結核病年報》估算，我國耐多藥結核病患者數居世界第二位[1]。2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，全國總耐藥率為42.1%，耐多藥率為6.8%，廣泛耐藥率為2.1%[2]。因此，控制耐藥和耐多藥(MDR)結核病的流行已經成為中國結核病防治工作的迫切任務。

乙胺丁醇(ethambutol，EMB)是1961年開始應用在結核病治療上的一種人工合成的具有廣譜抗分枝桿菌活性的一線抗結核藥物。2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查結果顯示，280株結核分枝桿菌復合群菌株對EMB的耐藥率為6.8%[1]，且在以往的研究表明，在我國的某些地區耐多藥結核同時表現出對EMB耐藥的有50.5%～66.7%。因此，建立快速準確的EMB耐藥檢測方法對于選擇有效的結核治療方案至關重要，而了解EMB耐藥相關基因的突變特征可為建立快速診斷方法提供分子基礎。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究的139株 MDR-TB(耐多藥結核分枝桿菌)菌株來自北京胸科醫院2005年和2015年就診患者的臨床分離株，所有菌株均經對硝基苯甲酸(PNB)抑制生長試驗鑒定為結核分枝桿菌。

1.2試劑儀器 藥敏試驗所用乙胺丁醇購買于Sigma公司，營養添加劑OADC購買于美國BD公司，羅氏培養基購買于珠海銀科公司，96孔板購買于美國Costar公司，阿爾瑪藍(Alamar blue)購買于美國Bio-Rad公司

1.3藥物敏感性測定 微孔板阿爾瑪藍顯色法 (micro plate alamar blue assay, MABA)藥敏試驗：刮取羅氏培養基上生長4周左右的新鮮菌落置于磨菌瓶中研磨均勻，稀釋菌懸液并比濁至1麥氏，再以1∶20比例用7H9培養基稀釋菌液。向預制含有不同濃度EMB的96孔板的每孔中加入100 μL菌液，37 ℃培養7～9 d，再向微孔板中加入20 μL阿爾瑪藍和50 μL 5% Tween-80的預混顯色液，37 ℃繼續培養24 h后觀察96孔板顏色變化。判定標準：藍色孔為無菌生長，粉色孔為有菌生長，藍色孔的最低藥物濃度記為能抑制結核分枝桿菌生長的MIC。當MIC大于臨界藥物濃度時判斷為耐藥，反之則為敏感按照。定義EMB耐藥界定濃度為EMB≥5.0 μg/mL，當5.0 μg/mL≤MIC≤20.0 μg/mL時，定義為低濃度耐藥；當MIC≥40.0 μg/mL時，定義為高濃度耐藥。

1.4核酸提取 用接種環刮取菌落置于加有0.5 mL生理鹽水的EP管中，然后100 ℃水煮30 min，再13 000 r/min離心5 min，吸取上清大約500 μL存放于1.5 mL EP管中。

1.5目的基因擴增、測序及測序數據分析 PCR擴增采用的上下游引物分別為5′CTGACCGACGCCGTGGTGATAT3′ 和 5′TGAATGCGGCGGTAACGACG 3′。反應體系為：12.5 μL 2×Master MIX，上游引物和下游引物各0.5 μL，2 μL的DNA模板，10.5 μL去離子水。反應條件：預變性95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，總計35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物送北京擎科生物技術有限公司測序。測序結果采用BioEdit軟件與標準菌株H37Rv基因序列進行比對

1.6PCR產物經電泳鑒定后，進一步送睿博興科公司測序。利用軟件DNAstar Lasergene進行序列拼接和與embB基因標準序列的比對，分析突變位點。

1.7統計學處理 應用SPSS 22.0軟件進行分析，比較2005年和2015年敏感和耐藥菌株數兩組間的差異分析采用完全隨機設計的兩樣本率比較(卡方檢驗)，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PCR產物電泳圖 見圖1。

*1號孔為100 bp marker，2-4,6-8號為PCR產物，5號孔為空白圖1 PCR產物電泳圖Fig.1 PCR product electropherogram

2.22005年和2015年結核病患者耐藥情況之間的比較 2005年入選的63株MDR菌株對EMB耐藥的有57株，其中低耐藥菌株有40株，耐藥率合計為70.18%；高耐藥菌株有17株，耐藥率合計為29.82%。2015年入選的76株MDR菌株中對EMB耐藥的有71株,其中低耐藥菌株有57株，耐藥率合計為80.28%；高耐藥菌株有14株，耐藥率合計為19.72%。比較2005年和2015年敏感和耐藥兩組間的差異分析采用完全隨機設計的兩樣本率比較(卡方檢驗)，沒有統計學差異(χ2=0.410，P<0.05)。

2.3DNA測序結果 本研究發現2005年檢測的63株MDR中有43株攜帶embB突變，突變位點共7種分別為ebmB306、ebmB319、ebmB328、ebmB330、ebmB354、ebmB405、ebmB406，其中常見的突變位點為embB306(26株，60.5%)和embB406(11株，25.6%)。2015年檢測的76株MDR中有56株攜帶embB突變，檢出位點共有6種ebmB297、ebmB306、ebmB319、ebmB354、ebmB405、ebmB406。

其中常見的突變位點為embB306(42株，75.0%)和embB406(6株，14.3%)。兩年一共檢測的139株MDR中有99株攜帶embB突變，占所有MDR的71.2%；未攜帶突變的有40株，占所有MDR的28.8%。其中有1株菌為雙位點突變，其余株菌均為單位點突變。此外，還發現了2種未被記錄入tbdreamdb MTB基因數據庫的突變位點，分別為embB354(圖2)和embB405(圖3)。比較2005年和2015年突變類型的差異，分析采用群組卡方檢驗，沒有統計學差異(χ2=9.410，P<0.05)。

圖2 embB354(GAC/GCC)位點突變測序圖Fig.2 embB354 (GAC/GCC) site mutation sequencing map

圖3 embB405(GAG/GAC)位點突變測序圖Fig.3 embB405 (GAG/GAC) site mutation sequencing map

2.42005年和2015年MDR基因突變與EMB藥敏相關性分析 本研究的MDR中耐EMB菌株攜帶embB突變的比例為71.01%，野生型為29.0%。297位點突變有1種突變形式，為低水平耐藥。306位點5種突變形式，后文詳細分析。319位點共有4種突變形式，均為低水平耐藥。328位點有2種突變形式，均為低水平耐藥。330位點突變有1種突變形式，為高水平耐藥。354位點有2種突變形式，低水平耐藥率為66.7%,高水平耐藥率為33.3%。405位點有2種突變形式，低水平耐藥率為50.0%,高水平耐藥率為50.0%。406位點有4種突變形式，主要與低水平耐藥率相關(70.6%)(見表1)。

embB基因不同突變類型引起不同水平的對EMB耐藥，306位點的突變中ATG/GTG (Met102Val) 這種突變形式所占比例最高，并且這種突變形式表現出對EMB低水平耐藥，耐藥率為50.0%。其他的4種突變形式ATG/ATA (Met102Ile)、ATG/ATC (Met102Ile)、ATG/ATT (Met102Ile)、ATG/CTG (Met102Leu)也主要表現與低水平耐藥相關。

3 討 論

乙胺丁醇作用于分枝桿菌阿拉伯糖基轉移酶，通過抑制阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳聚糖，影響細胞壁分枝菌酸-阿拉伯半乳聚糖-蛋白聚糖復合物的形成,引起細菌細胞壁結構改變，最終導致細菌死亡[3]。因與其他一線抗結核藥有協同作用，且可延緩其他藥物耐藥性的產生，被普遍用于臨床治療，導致其耐藥率高，對比2005年和2015年數據發現兩年的耐藥率有統計學差異，說明EMB在臨床使用的普遍率。在其他研究中，MDR對EMB的耐藥率為50.5%～66.7%[4-5]。而本研究中，MDR對EMB的耐藥率為92.1%(128/139)，可能與我院是結核病?？漆t院，所收治的大多為反復治療的病人，其耐藥水平普遍偏高有關。其他國家如波蘭，檢測MDR中對EMB的耐藥率為34.0%(17/50)[6]，低于我國水平。因此，我國的MDR患者確定用藥方案前可先檢測其embB基因突變情況。當MTB對EMB產生低濃度耐藥時，可以通過提高藥物的劑量以達到治療的目的，對于高水平耐藥的患者，可考慮換用其他藥物治療。

表1embB不同突變類型與EMB耐藥水平的關系
Tab.1 Relationship between different types ofembBmutations and EMB resistance

突變位點堿基替換氨基酸改變樣本數不同MIC(μg/mL)對應的樣本數0.6251.252.55102040≥80embB297TCG→GCGSer→Ala100010000embB306ATG→GTGMet→Val440005121719ATG→ATAMet→Ile1700064304ATG→ATCMet→Ile300020001ATG→ATTMet→Ile200011000ATG→CTGMet→Leu200011000embB319TAT→GATTyr→Asp100010000TAT→TGTTyr→Cys200002000TAT→TCTTyr→Ser100001000TAT→AATTyr→Asn100010000embB328GAT→GGTAsp→Gly100000100GAT→TATAsp→Tyr100000100embB330TTC→GTCPhe→Val100000010embB354①GAC→GCCAsp→Ala300010101GAC→AACAsp→Asn100000001embB405①GAG→GACGlu→Asp200001001embB406GGC→GCCGly→Ala800015011GGC→GACGly→Asp600120003GGC→TGCGly→Cys100001000GGC→AGCGly→Ser200010100突變型合計--99001232823321野生型--40037106707合計--139038333430328

①未被記錄入tbdreamdb MTB基因數據庫的突變位點。

注：(1)其中一株菌為306位點和354位點的雙突變，歸類至306突變中；(2)Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸

還有大量研究MDR和embB基因突變的數據，一篇研究河南結核病embB基因突變的研究中報道MDR中攜帶embB基因突變的比率為86.2% (119/138)[7]；另一篇報道深圳市MDR中攜帶embB基因突變的比率為82.4%(42/51)[4]，也與之相似。本研究的MDR中耐EMB菌株攜帶embB突變的比例為71.01%，略低于河南和深圳，可能是由于本研究還納入了2005年的63株MDR，2005年MDR中攜帶embB基因突變的比率為68.3%(43/63)。對比其他國家，一篇研究波蘭MDR的文章中報道了對EMB耐藥的MDR中攜帶embB突變的比率為76.5%(13/17)[6]，導致上述差異可能是由于embB基因的突變存在地區性差異。

在本研究中發現，對EMB敏感的菌株也可以發生embB基因突變，有一株MIC為2.5 μg/mL的菌株在embB406位點發生了突變。其他研究也有報道[7-8]。還有些報道描述了對EMB敏感的菌株在embB的306位點有突變[9-10]。有2個對EMB敏感的分離株中embB306位密碼子存在突變的解釋：推薦用于藥物敏感性試驗的EMB濃度取決用于敏感性測試的表型方法，其范圍為2～7.5 μg/mL(EMB)；可能由于這類embB306位密碼子存在突變的分離株的MIC接近EMB耐藥的界定濃度。推測在406位密碼子存在突變的原因與之相類似。

本研究發現了2種未被記錄入tbdreamdb MTB基因數據庫的突變位點embB354和embB405。其中第354位發現有天冬氨酸突變為丙氨酸和天冬酰胺這兩種突變形式，以天冬氨酸突變為丙氨酸占比多(75%)，3株菌株中2株為低水平耐藥，1株為高水平耐藥。天冬氨酸為極性帶負電荷的氨基酸，而丙氨酸為非極性氨基酸，因此兩種氨基酸存在較大的差異，導致EMB靶標embB結構的顯著改變，從而影響了MIC。此外，這2種突變位點在其他研究中也有相關報道[11-12]，提示需要根據新報道的文獻對tbdreamdb MTB基因數據庫進行更新調整。

利益沖突：無