小RNA病毒3C蛋白功能的研究進展

曹圣慧，黃孝天

1 小RNA病毒科的基因組結構與致病性

1.1小RNA病毒基因組結構 小RNA病毒科基因組為單正鏈RNA，大小為6.7～10.1 kb，病毒顆粒呈球形，無被膜包被，病毒衣殼為二十面體結構[1]。小RNA病毒基因組結構高度保守，包括5′非編碼區(5′-noncoding region，5′-NCR)、開放閱讀框、3′非編碼區(3′-NCR)和3′端的polyA尾。5′-NCR包含多個RNA二級結構元件，其中一個重要的二級結構元件是內部核糖體進入位點(Internal ribosome entry site，IRES)，IRES三葉草結構與細胞蛋白質相互作用后招募核糖體，啟動病毒基因組的翻譯。病毒基因組開放閱讀框包括3個部分，分別為P1區、P2區和P3區。P1區經翻譯加工后形成結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4，組成病毒的衣殼結構。P2區和P3區分別翻譯加工形成非結構蛋白2A、2B、2C以及3A、3B、3C、3D。其中，2A蛋白和3C蛋白分別參與病毒蛋白的剪切。3′-NCR和病毒的復制效率相關，3′端的polyA尾參與病毒的復制和翻譯[2]。

1.2常見小RNA病毒的致病性 小RNA病毒科包括35個屬，80個種[1]。許多小RNA病毒可引起人和動物的腦部、心臟、肝臟、皮膚、胃腸道或上呼吸道疾病，且目前無有效的疫苗用于治療。常見的小RNA病毒包括腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV-71)、腸道病毒D68型(Enterovirus D68，EV-D68)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus，CV)、脊髓灰質炎病毒(Poliovirus，PV)、甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)、鼻病毒(Human rhinovirus，HRV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)、腦心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)等。EV-71、CV-A2、CV-A16、CV-A6和CV-A10可導致每年亞太國家數百萬兒童患手足口病，甚至引起更嚴重的臨床癥狀，如無菌性腦膜炎、急性遲緩性麻痹和神經呼吸系統綜合征[3]。CV-B4可引起新生兒心肌炎、Ⅰ型糖尿病以及神經性疾病[4]。EV-D68可引起世界范圍內人類呼吸道疾病的流行[5]。EMCV可引起動物腦炎、心肌炎為主要特征的急性傳染病，FMDV可導致牛羊等動物口蹄疫的暴發流行，對農業生產造成重大的經濟損失[6-7]。

2 小RNA病毒3C蛋白的結構

小RNA病毒的3C蛋白包含175～253個氨基酸，大小為19～28 kD。3C蛋白集絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶特性為一體。作為絲氨酸蛋白酶，3C蛋白具有催化三聯體Cys-His-Glu/Asp[8]。作為半胱氨酸蛋白酶，3C蛋白具有特征催化基序Gly-X-Cys-Gly[9]。近年來，多種小RNA病毒如HRV、PV、HAV等的3C蛋白晶體結構顯示，3C蛋白都具有二個相同的、6條反向平行鏈構成的、呈約90°的β-桶狀(β-barrel)結構域，二個結構域之間延伸出一個可結合底物的淺槽。其中，由十幾個氨基酸殘基構成的環狀結構位于淺槽的上方，稱為β-折疊(β-ribbon)，它對底物的特異性識別具有重要作用[9](圖1)。研究顯示HRV、PV、HAV、FMDV中3C蛋白的β-折疊為閉合構象，而EV-71中3C蛋白的β-折疊是一種開放構象，位于β-折疊基底的Gly-123和 His-133控制著β-折疊的靈活性[10]。

圖1 EV-71的3C蛋白結構[10]Fig.1 Structure of EV-71 3Cpro[10]

3 小RNA病毒3C蛋白的功能

近年來對于小RNA病毒3C蛋白的研究表明，該蛋白參與病毒前體蛋白的剪切，與促進病毒復制、調控細胞凋亡以及逃避免疫應答等密切相關。

3.1促進病毒復制 由于自身基因組的限制，許多病毒依賴于宿主細胞來完成自身的復制。研究發現3C蛋白可裂解多種蛋白如poly-A結合蛋白(poly(A)-binding protein，PABP)、剪接因子脯氨酸和谷氨酰胺(Splicing factor proline and glutamine rich，SFPQ)、蛋白激酶R (protein kinase R，PKR)等。這些蛋白對病毒復制的影響是不同的。Sun等研究表明鴨甲肝病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)的3C蛋白可裂解PABP蛋白中 Q367和G368之間的特異性位點，PABP蛋白被裂解為N端片段和C端片段，N端片段的存在利于DHAV的復制，而C端片段則截然相反。C端片段的功能被細胞所抑制的機制尚不清楚[11]。Kobayashi等研究結果顯示EMCV的3C蛋白可裂解PABP蛋白中的Q437和G438之間的特異性位點，導致一個N端45 kD的蛋白在病毒感染的細胞中累積，促進病毒的復制。而當PABP的裂解受到干擾時，病毒的復制明顯受到抑制。因此，EMCV的3C蛋白可通過裂解PABP而促進病毒復制[12]。此外，Dylan等研究顯示HRV的3C/3CD 可裂解SFPQ，而SFPQ水解片段的產生導致病毒復制以及病毒顆粒的增多[13]。Chang等人發現EV-71感染宿主時，3C通過裂解PKR增強了病毒的復制[14]。Yao等發現槲皮素能夠結合EV-71 3C蛋白的底物識別位點從而抑制其活性，以及抑制宿主體內的病毒復制，推斷槲皮素抑制病毒復制的機制可能與3C蛋白的活性有關[15]。

3.2調控細胞凋亡 病毒感染宿主后可導致宿主細胞發生凋亡。研究表明小RNA病毒的3C蛋白可通過激活半胱天冬酶(caspase)活性，裂解PinX1蛋白、真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factor 4GI，eIF4GI)和受體相互作用蛋白激酶Ⅰ(Receptor-interacting protein kinase-1，RIPK1)調控細胞凋亡[16]。Li等研究結果顯示，當神經細胞表達EV-71的3C蛋白時，細胞以DNA片段化和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly(ADP-ribose) polymerase，PARP)裂解的形式發生凋亡。其中，PARP裂解是caspase被激活的特異性標志，說明3C蛋白可激活caspase誘導細胞凋亡[17]。Song等發現EV-71感染宿主后，3C蛋白可與caspase -8，9相互作用而激活caspase-3誘發凋亡，當3C失去水解活性后，細胞caspase -8，9活性明顯降低，細胞凋亡明顯減少[18]。Chau等發現CV-B3的3C蛋白裂解宿主細胞的eIF4GI，導致細胞翻譯過程受到抑制，最終細胞發生形態改變，皺縮等形式的凋亡[19]。Li等研究表明當EV-71感染宿主細胞時，3C蛋白能裂解PinX1蛋白中Q50-G51的特異性位 點，PinX1表達降低可使細胞DNA損傷，增加細胞凋亡的易感性[20]。與上述不同的是，Sarah等發現HRV-16的3C蛋白和caspase 8能裂解外在凋亡途徑的關鍵中間體，即RIPK1。二者裂解RIPK1的位點和功能不同，caspase 8裂解RIPK1產生一個38 kD的蛋白，促進細胞發生早期凋亡，而3C蛋白進一步裂解38 kD的蛋白產生C末端23 kD的片段，抑制了凋亡的進一步發展[21]。

3.3逃避免疫應答 病毒感染宿主后，宿主啟動固有免疫應答，如產生干擾素(interferon，IFN)和免疫因子抵御感染，而病毒通過一些策略逃避固有免疫應答的清除。研究表明3C蛋白通過抑制IFN的產生和核轉錄因子-κB(NF-κB)通路逃避免疫應答(圖2)。Rui等研究發現CV-A6、CV-A16、和EV-D68等小RNA病毒感染細胞，3C蛋白能與黑色素瘤分化相關基因(Melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5)、維甲酸誘導基因-I(Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I)相互作用，破壞了RIG-I 和MAD5與通路下游線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)的結合，從而使MDA5、RIG-I介導的IFN I的產生受到抑制。3C蛋白還可抑制IRF3的磷酸化，從而抑制IFN I的產生[22]。Lei等研究表明EV-71的 3C蛋白與RIG-I的N端相互作用，抑制RIG-I與MAVS形成復合物，同時3C蛋白與β干擾素TIR結構域銜接蛋白 (TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β, TRIF)相互作用后誘導TRIF裂解，3C蛋白還可直接裂解IRF7 Q189和S190之間的位點，最終上述現象都抑制IFN I產生[23-25]。

NF-κB通路對于宿主抵抗病毒感染也至關重要。病毒感染后宿主可通過激活NF-κB通路，刺激機體產生抗病毒相關的免疫因子與細胞因子。3C蛋白可通過裂解TRAF家族與轉化生長因子激酶1(transforming growth factor-βactivating kinase 1，TAK1)、TRIF、NF-κB相關激活因子(TRAF family member-associated NF-κB activator，TANK)抑制NF-κB通路活性。Lei等研究發現EV-71的3C蛋白裂解TAK1、TAK1結合蛋白1(TAK1 binding protein 1，TAB1)、TAB2和TAB3，破壞TAK1與TAB1、TAB2和TAB3形成復合物，從而抑制TAK 1復合物對NF-κB通路的激活和細胞因子的產生[26]。Xiang等研究表明在EV-D68中，作為半胱氨酸酶的3C蛋白可裂解TRIF的312和653位點，而導致TRIF失活。失活的TRIF抑制對NF-κB通路的激活，最終抑制宿主的免疫應答[27]。Huang等人研究EMCV發現3C蛋白能裂解TANK 蛋白的197和291谷氨酰胺位點。TANK即TRAF家族與NF-κB相關激活因子(TRAF family member-associated NF-κB activator，TANK)，是NF-κB的關鍵調控因子。3C蛋白對TANK的裂解破壞這種抑制作用，可抑制TRAF-6介導的NF-κB通路的激活，這是一種新的小RNA病毒逃避宿主免疫的策略[28]?？偠灾?，小RNA病毒通過3C蛋白逃避免疫應答較為復雜，對3C蛋白的功能的探索有助于進一步闡明小RNA病毒的致病機制。

圖2 小RNA 病毒3C蛋白調控免疫應答的機制Fig.2 Mechanisms of picornavirus 3C protein regulate the immune response

4 展 望

3C蛋白在小RNA病毒自身復制和與宿主的相互作用中發揮了重要作用。目前，3C蛋白抑制劑的研究是抗病毒藥物的熱點，研究小RNA病毒3C蛋白的功能，不僅能為深入研究小RNA病毒的致病機制奠定基礎，還可為研發病毒疫苗以及抗病毒藥物提供新的思路。

利益沖突：無