金黃色葡萄球菌VII型分泌系統研究進展

張保海，姚學萍，王 印,2，楊澤曉，羅梓丹，項明源，江地科

金黃色葡萄球菌可引起動物和人類多種疾病，是人獸共患重要病原菌之一，其自身攜帶的多種毒力因子與其致病力有緊密聯系，而這些毒力因子的分泌在很大程度上則依賴于細菌分泌系統，在革蘭氏陽性菌蛋白分泌中發揮重要作用主要是VII型分泌系統。

1 Ⅶ型分泌系統的發現

革蘭氏陰性菌的蛋白分泌異常復雜，因為這些細菌有兩層膜結構，這些蛋白質必須通過這兩層膜進入細胞外環境或宿主細胞。與革蘭氏陰性細菌相比，分枝桿菌在其表面存在大量羥基化支鏈脂肪酸稱為分枝菌酸，分枝菌酸共價連接到細胞壁基質形成第2個疏水屏障，稱為分枝菌酸膜，而蛋白分泌要跨越分枝菌酸膜就需要1種特殊的蛋白分泌系統，最近的研究證明革蘭氏陽性細菌中存在專門的蛋白分泌系統，即細菌VII型分泌系統[1-2]。Ⅶ型分泌系統(Type Ⅶ Secretion System，T7SS)首次在結核分枝桿菌和牛分枝桿菌中發現，T7SS系統中的ESX-1系統分泌兩種小蛋白質(ESAT-6和CFP-10)，現已分別命名為EsxA和EsxB，并且已證明它們在細菌毒力分泌方面發揮重要作用[3]。除了分泌EsxA 和EsxB蛋白之外，分枝桿菌T7SS還可以分泌更大的脯氨酸-谷氨酸蛋白(Proline-glutamicacid，PE)/脯氨酸-脯氨酸-谷氨酸蛋白(Proline-proline-glutamic acid，PPE)家族蛋白，這些蛋白質在某些物種的基因組中是大量存在的[4-5]。通過對ESX-1基因座進行鑒定，還確定了在一個物種中存在多達5個不同位點的同類基因座，稱為ESX-1至ESX-5[6]。雖然在分枝桿菌中可以存在5個不同的ESX基因座，但大多數物種的ESX基因座數量較少。ESX-1和ESX-5兩個系統參與細菌毒力分泌，也會影響致病性分枝桿菌在細胞間遷移[2-3]。ESX-5系統作為分枝桿菌最活躍的分泌系統，它的存在可能與分枝桿菌快速增長的差異相關；ESX-3系統參與細菌體內鋅、鐵平衡； ESX-5、ESX-3和ESX-1參與蛋白質的分泌；ESX-2和ESX-4的功能目前尚不清楚[3,5]。然而，近年的研究發現金黃色葡萄球菌基因組中也存在與結核分枝桿菌ESX基因同源的基因簇[7-8]。金黃色葡萄球菌外毒素、表面蛋白和調節分子是重要的毒力因子，EsaB和EsaC基因在調節這些因子方面取得了很大進展[2,5]。對于金黃色葡萄球菌中的許多毒力因子，Ess簇的調節也是比較復雜的。

2 金黃色葡萄球菌T7SS及功能

金黃色葡萄球菌基因組編碼專門的分泌系統ESS(ESAT-6分泌系統)，ESS蛋白分泌系統促進效應蛋白通過細菌包膜轉運，也是金黃色葡萄球菌建立持續性膿腫病變和血液感染期間免疫應答調節所必需的，該系統包括8個基因簇(esxAB、essABC、esaABC)(圖1)[9-10]。ESS編碼的esxA、esxB、esaC參與膜蛋白的穩定表達，這些基因指定了3種分泌的多肽底物[4-5]。此外，EsxA和EsxB的分泌相互關聯，EsxA的分泌依賴于EsxB的存在，這種共同依賴性與結核分枝桿菌中的ESAT-6和CFP-10極其相似，而不能分泌EsxA和EsxB的金黃色葡萄球菌突變體的毒性則顯著降低，并存在傳播和定植缺陷[8,11]。ESS基因座還包含12個編碼序列(CDs)，編碼跨膜蛋白的2個CDs(特別是essA和essB)同樣參與蛋白分泌[4-5,12]。

蛋白的分泌既有相互協同，也存在相互抑制。如EsxA和EsxB需要EssA、EssB和EssC協作轉運通過葡萄球菌包膜分泌[13]。esaB編碼一種小的細胞質蛋白，有抑制esaC合成的作用，但不抑制esxA和esxB的合成；esxB可與新的底物esxD和esxA結合，與其自身或esaC二聚化；esaD位于esxB的下游，其表達通過esaB和essB的突變激活，缺乏esaD的金黃色葡萄球菌突變體顯示出建立持續性膿腫病變的能力缺陷[5,14-15]。esxC是一種保守的金黃色葡萄球菌蛋白，是ESS的底物，在膿腫形成初期所發揮的作用很小，但在膿腫的長期持續中有顯著作用[9,16]。未能分泌EsxA和EsxB的金黃色葡萄球菌會導致膿腫感染小鼠模型的毒力降低，表明ESS途徑參與急性葡萄球菌感染的發病機制[8,12,17]。

圖1 ESS基因座結構示意圖[9]Fig.1 Structure of ESS Locus[9]

3 T7SS分泌底物與調控

ESX系統中只有ESX-1、ESX-3和ESX-5參與蛋白質的分泌，而經由ESX-2或ESX-4為底物的主動分泌系統還未被證實[1,18-19]。ESX基因座是以第一個被鑒定的分泌底物命名的，即EsxA。EsxA屬于更大的蛋白質家族WXG100蛋白。WXG100超抗原家族還包括EsxB，EsxA和EsxB可形成二聚體螺旋發夾結構(圖2)，并且在厚壁菌門中EsxA作為折疊的同型二聚體；其次EsxA和EsxB對巨噬細胞中結核分枝桿菌的復制至關重要，并且可能也與病原體抑制先天性和適應性免疫應答的能力相關[20-22]。EssC除外，另外3種膜蛋白EsaA、EssA、EssB對于T7SS分泌活性以及分泌蛋白EsxA和細胞質蛋白EsaB是必需的[23]。通過對NCTC8325 T7SS基因簇的菌株(包括金黃色葡萄球菌Newman、USA300和RN6390)進行的研究已經將EsxB、EsxC和EsxD鑒定為T7SS的分泌底物，這3種蛋白很小，僅有100～130氨基酸，它們的確切功能還有待進一步闡明[8,16-17]。

圖2 ESAT-6-CFP-10二聚體的結構[20-22]Fig.2 Structure of the ESAT-6-CFP-10 dimer[20-22]

ESX系統存在5種分泌系統ESX-1～ESX-5，但卻彼此不互補，這是由于4個ESX系統(ESX-2～ESX-5)無法補充由于ESX-1缺失而導致的毒性減弱或喪失[5-6,8]。這對ESX-5尤其顯著，因為ESX-5和ESX-1似乎都參與了巨噬細胞的逃逸和細胞間的擴增。這可能意味著這2個分泌系統在細胞感染周期的進程中具有獨立的作用。不同的ESX系統不能互補，這可能是由于它們的分泌信號的不同，以及它們的調節方式不同[8,18]。雖然5個ESX分泌系統似乎都是獨立運作的，但也存在一定程度的交叉，ESX-3和ESX-5基因座編碼的Esx蛋白的分泌就是很好的例證[6,8,19]。最近有研究表明，由ESX-3位點編碼的EsxGH也形成與EsxAB具有相似結構特征的異二聚體[20,24]。PE和PPE蛋白雖然在結構上與ESX蛋白結構相似，但是這兩種蛋白是由不同的ESX系統分泌的底物，它們也可以形成異二聚體結構，當單獨表達時，單個蛋白表現不穩定[25]。雖然已證明PE和PPE蛋白會被不同的ESX系統分泌，但絕大部分似乎被ESX-5分泌，這使得ESX-5系統成為分枝桿菌中含有許多PE/PPE基因最活躍的分泌系統[4,18,20]。根據對T7SS系統折疊二聚體結構的觀察，由這種“單一”esx基因編碼的金黃色葡萄球菌WXG100成員之間形成同源二聚體而不是異二聚體。對于ESX-1系統而言，編碼分泌底物的為esp基因(EspA-EspC、 EspE、 EspJ、EspK)，除了espA和espC位于獨立操縱子之外，其他基因都位于ESX-1基因座，由于ESX-1含有多個esp基因，因此底物的變化幾乎是唯一的[26-28]。

4 T7SS對金黃色葡萄球菌毒力分泌的調控

在結核分枝桿菌毒力中起重要作用的是EsxA和EsxB[29]。同時，EsxA和EsxB也是金黃色葡萄球菌感染發病所必需的，這兩種蛋白是由ESAT-6系統分泌的，而ESAT-6系統是金黃色葡萄球菌專門的分泌途徑，其有助于血源性感染發病[30-32]。除了WXG100蛋白EsxA和EsxB，金黃色葡萄球菌的ess基因簇還含有EssABC。同時，Ess途徑也是一種交替的分泌系統，使人聯想到許多病原體的交替分泌系統，這些交替分泌系統將多肽轉運穿過細菌胞膜。與大多數交替分泌系統一樣，Ess途徑似乎只能運輸有限的一組底物[8,22,33]。

EsaC是金黃色葡萄球菌分泌系統ESS分泌的底物蛋白質，essC是ESAT-6分泌系統的重要組成部分，破壞essC基因可以消除esaC的分泌和在葡萄球菌細胞質中積累的蛋白質[8,34]。利用缺少esaB的USA300和Newman菌株，將金黃色葡萄球菌的培養物分離成細胞質、細胞膜、細胞壁和培養基，并用特異性抗體進行免疫印跡揭示所有組份中的蛋白質。結果發現Newman不會產生EsaC，然而，在缺乏esaB的USA300和Newman菌株的培養基中發現了EsaC，但在細胞質、膜和細胞壁中均沒有發現EsaC[8-9,14,35]。這些結果表明EsaC的產生受EsaB的調節。

有研究表明T7SS在小鼠感染模型中具有毒性，并促進細胞內金黃色葡萄球菌從上皮細胞釋放[4,16]。另有研究確定了金黃色葡萄球菌T7SS在細菌競爭中發揮的作用， EsaD是T7SS的一種核酸酶毒素，其分泌依賴于輔助蛋白EsaE，在其生物合成過程中EsaD的毒性活性通過與抗毒素EsaG形成復合物而被中和[5,12,20,36]。不編碼EsaD底物的金黃色葡萄球菌菌株具有esaG同源物，最有可能保護自己免受EsaD生產菌株的殺死，為了支持這個觀點，研究發現過量產生EsaD的菌株引起對敏感菌株的顯著生長抑制[3,15,37]。此外，esaD和esaE存在共分泌，esaG僅在細胞質中被發現并且可能在分泌過程中被剝離[14,36,38]。esaG的存在抵消了EsaD的毒性活性，表明esaG是一種蛋白質抗毒素，并且通過細菌雙雜交分析證實EsaD-EsaG的相互作用，EsaG通過直接作用阻斷esaD的活性；EsaG也是EsaD穩定性或分泌所必需的[5,39-40]。然而，EsaG不是分泌EsxA或EsxC所必需的，因此不是普通的T7SS輔助因子[16,41]。

T7SS表現出的這些功能可能與其一些特性存在某種聯系，這些T7SS底物存在一個特殊的性質是當分泌系統被阻斷時，一些蛋白質通常不會積聚在細菌細胞中[5,9,29]。這種特性在不同的ESX系統和不同的突變中較常見，表明其可能是一種保守特性，并可以感知底物的細胞質積聚[4,16,20]。由此可見，底物調控有一個特定的反饋機制，該機制不僅可以在轉錄起始水平上起作用，而且可能涉及RNA穩定性、蛋白質翻譯起始和蛋白質穩定性。T7SS底物的另一個特性就是共依賴分泌[20]。EsxA和EsxB異二聚體的分泌取決于這兩種蛋白質的存在，對于ESX-1分泌而言，這種依賴性似乎更加廣泛，如EspA及其伴侶蛋白EspC的分泌依賴于EsxAB的存在，反之亦然[9,20,30]。同樣的EspB的分泌取決于EspA的表達，但不依賴于EsxAB的存在[5,29-30]。然而，這種相互依賴關系未被詳細研究，我們還不清楚EspB和EspA是否以共依賴的方式分泌，并且這種現象背后的分子機制尚不清楚。

5 展 望

自VII型分泌系統被發現以來，研究者圍繞該系統的基因結構、分泌底物組成和功能及相關調控機制等方面進行了大量的研究。最近的研究表明單順反子esxA轉錄物由sigma A(σA)啟動子驅動，進而推測在Newman菌株中σB啟動子是非活性的。該分析還揭示了esxA轉錄物在sarA突變體中積累，但在agr，arlR和spoVG突變體中減少[42-43]。因此，esxA表達受已知微調分泌蛋白組的幾種轉錄因子調節，以便協調致病性與細菌細胞密度和環境之間的關系。目前尚不清楚為什么一些Esx蛋白質自我結合而其他蛋白質作為異二聚體相互作用，顯然分泌物的一個特征是相互關聯，但亞基在宿主中不相互關聯。此外，結構折疊對于廣泛中和抗體的誘導可能是獨特和難以控制的。在金黃色葡萄球菌中，ESS途徑是感染動物中、深部膿腫持續存在所必需的[5,9,23,44]。4種分泌的蛋白質必須借助于這一過程，確切功能和宿主目標仍有待確定。

金黃色葡萄球菌分泌兩種WXG100蛋白，EsxA和EsxB以及第3種多肽EsaC。通過對膿腫形成小鼠模型中的EsaB和EsaC突變體分析，揭示了金黃色葡萄球菌感染期間EsaC產生和分泌的作用[2,8-9]。通過觀察發現輔助因子EsaB可能有助于葡萄球菌感染的持久性。此外，葡萄球菌在進入宿主組織時產生和分泌EsaC[45]。 EsaC的產生受EsaB的調節，EsaB是在Ess簇內編碼的細胞質保守蛋白[46]。 EsaB似乎以轉錄后的方式抑制EsaC的產生，缺乏EsaB的細菌會過量產生EsaC，而野生型細菌則不會，除非它們在宿主組織中復制[9,14]。EsaB如何介導抑制并感知環境信號仍然未知。盡管無法描述EsaB的生化功能，但EsaB不僅調節EsaC，還調節其他因素，這些因素有助于建立持續性感染[35,45]?？傊?，研究指出Ess基因座是金黃色葡萄球菌的新型分泌途徑，其可能干擾宿主免疫應答并促進細菌建立類似于結核分枝桿菌的慢性持續性感染途徑。

通過進一步探究ESAT-6因子的免疫應答是否可以保護宿主抵抗葡萄球菌的感染，或者缺乏ESAT-6決定簇的突變體是否可以用于減毒金黃色葡萄球菌菌株的活疫苗設計，該領域的工作在未來有望成為研究熱點。揭示EsxA/EsxB分泌機制和EssA、EssB、EssC底物的全部特性，或者可能指出預防由金黃色葡萄球菌引起的動物和人類多種疾病的新策略，特別是耐藥菌株對已知抗生素具有抗藥性以及相關抗性形成的機制。

利益沖突：無