寧春4號與河東烏麥雜交F2品質性狀及其分子標記分析

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(1.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021； 2.寧夏農林科學院 農作物研究所，寧夏 銀川 750001)

小麥(TriticumaestivumL.)是一種適應性強、分布廣泛的世界性糧食作物，為全球35%～40%人口提供主糧。我國是世界上最大的小麥生產國和消費國，小麥年生產總量和消耗總量占世界小麥年生產總量的17%和消費總量的16%，小麥生產的持續發展對保障國家糧食安全具有重要意義[1]。隨著人民生活水平的提高，對小麥品質的要求也逐漸提高，而我國小麥蛋白質含量平均為13.94%，面筋含量平均為30.40%，沉降值平均為32.10 mL，遠不能滿足人們的需求[2]。其中，蛋白質含量是小麥營養品質最重要的一項指標，而蛋白質質量由面筋含量、沉降值、流變學特性等加工品質決定[3]。因此，對于我國小麥品質改良來說，不僅要提高籽粒的蛋白質含量，更要改善和提高小麥加工品質[4-5]。蛋白質性狀為小麥品質性狀中的代表性性狀，其貢獻率比較大[6-7]。SHEWRY等[8]認為，表達的半胱氨酸肽酶基因數目與高分子質量麥谷蛋白亞基(High molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)總量存在劑量關系，即小麥品質的改良可通過增加HMW-GS數目來實現；而低分子質量谷蛋白亞基(Low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS)數量及HMW-GS、LMW-GS組合也對品質性狀有重大影響[9]。另外，HMW-GS的1、2*、17+18、5+10亞基和LMW-GS的GluA3f、GluB3b、GluB3g亞基與面團形成時間和穩定時間均呈顯著正相關，HMW-GS的N、1、14+15、17+18、7+8、2+12、3+12、4+12亞基和LMW-GS的GluB3d、GluB3f、GluB3h、GluB3g亞基與蛋白質和濕面筋含量均呈顯著正相關[10]。因此，HMW-GS、LMW-GS的數目及組合形式直接決定小麥品質的優劣。

DNA分子標記和QTL定位技術的發展為小麥品質性狀的分子檢測提供了有效的方法。目前，利用分子標記對小麥不同群體的蛋白質含量、沉降值、淀粉含量等品質性狀進行了大量研究[11-14]。同時，在QTL發掘方面，孫海艷等[15]共發現了15個分布在1D、3B、6D染色體上的蛋白質品質性狀QTL。解樹斌[16]發掘了涉及籽粒蛋白質含量的33個QTL，分布在1A、1B、4A、4B、6A染色體上，單個QTL的表型貢獻率為6.69%～15.52%，LOD值最大為7.3，同時，檢測到涉及沉淀值的33個QTL，分布在1A、1B、4B、5B、5D、6A、6D染色體上，單個QTL表型貢獻率為4.62%～18.73%，LOD值最大為13.6。李紅民[17]檢測到1個控制小麥籽粒硬度的主效QTL，LOD值為10。郭利建等[18]檢測到33個與品質性狀相關的QTL，其中,11個為粗蛋白含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、4B染色體上，表型貢獻率為0.69%～2.48%；12個為濕面筋含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、3B、4B染色體上，表型貢獻率為0.58%～2.37%；3個為沉降值QTL，分布在3A、1B、3B染色體上，表型貢獻率為2.72%～11.31%。雖然小麥品質相關性狀的QTL研究已有許多報道，但在育種上有利用價值的相關QTL還有待研究和應用。本研究針對寧夏回族自治區主栽小麥品種寧春4號綜合農藝性狀、適應性好，但品質一般，而育成于山西運城的河東烏麥籽粒蛋白質含量、面筋含量、沉降值均較高，在前期對2個小麥品種遺傳性狀與分子標記分析的基礎上[19]，構建了雜交組合群體，對其F2進行品質性狀及其分子標記分析，以期為寧夏回族自治區小麥品質性狀改良發掘可供利用的育種中間材料和QTL。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

寧春4號為寧夏回族自治區主栽小麥品種，河東烏麥由運城學院杜磊博士提供。2016年在寧夏大學教學試驗農場對寧春4號與河東烏麥進行正反交，同年將收獲的雜交種子在云南南繁加代，2017年將收獲種子種植于寧夏大學試驗農場，單粒點播，每行10粒，行長1.1 m，行寬0.2 m，獲得含331個單株的F2群體，其中正交后代201株(編號001—007、013—206)，反交后代130株(編號008—012、207—331)。

1.2 小麥品質性狀的測定

用瑞典波通9200整粒谷物紅外線分析儀測定籽粒含水量、硬度、蛋白質含量、沉降值、面筋含量[20]，在國家小麥改良中心西北分中心進行。

1.3 小麥品質性狀的分子標記分析

基因組DNA的提取采用SDS法[21]。前期根據小麥的7個部分同源群設計了SSR標記，本研究利用能夠在寧春4號與河東烏麥間穩定擴增的49個SSR標記[19]進行分析，其中對本研究材料品質性狀有明確QTL定位結果的5個SSR標記的名稱及序列見表1。2個分別與HMW-GS數目和面粉核黃素含量相關的標記Bx17、YP7A參照文獻[22-23]，具體信息見表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 SSR標記信息

PCR反應體系：10×Reaction Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 100 ng，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.05 μL，加ddH2O至總體積10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56～58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物檢測：采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電泳時總電壓為180 V，電泳約1.5 h，經銀染后觀察、照相，并統計擴增條帶。

1.4 數據分析

采用Excel 2013對品質性狀和分子標記結果進行統計；用SPSS 20進行方差、相關性和聚類分析；利用Origin 8.0對各品質性狀的頻率分布進行作圖；采用Map Manager QTXb 20進行QTL定位，取概率值P<0.05的LOD值作為判斷QTL存在的閾值，利用Kosambi函數中單標記回歸分析方法進行QTL分析，即檢測親本間有多態性的引物在F2群體中的分布，根據電泳譜帶結果建立SSR標記數據庫：與母本相同的帶型記為B，與父本相同的帶型記為A，雜合帶型記為H，缺失記為-。將331個F2單株的分子標記結果與品質性狀數據相結合，運用Map Manager QTXb 20軟件檢測相關QTL位點，QTL命名方法為：小寫字母q+目標性狀的大寫英文字母代稱+所在染色體號數，QTL全稱通常用斜體表示，如在5B染色體上，與穗長相關的QTL位點命名為qSL5B。

2 結果與分析

2.1 寧春4號與河東烏麥雜交F2品質性狀分析

2.1.1 品質性狀變異分析 對寧春4號與河東烏麥雜交F2的331個單株的5個品質性狀進行分析(圖1)發現，5個品質性狀在F2均出現較大分離，達到極顯著水平(P<0.01)，均呈連續正態分布，符合多基因控制的數量性狀的遺傳特點，并且出現了許多具有超親性狀的單株。

對F2群體品質性狀進行變異分析(表2)發現，籽粒蛋白質含量、硬度、面筋含量和沉降值的群體平均值均超過高親親本，含水量的群體平均值介于高親親本與低親親本之間。其中，含水量、蛋白質含量、面筋含量、硬度、沉降值的超中親比例分別達77.78%、84.52%、92.46%、73.41%、99.60%，超高親比例分別達46.63%、82.94%、90.48%、66.27%、99.60%。5個品質性狀的變異系數表現為沉降值(39.54%)>面筋含量(19.91%)>硬度(17.10%)>蛋白質含量(12.63%)>含水量(3.87 %)。

圖1 寧春4號與河東烏麥雜交F2品質性狀頻率分布Fig.1 Frequency distribution of quality traits in F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

品質性狀Quality traits寧春4號Ningchun No.4河東烏麥Hedong black wheat變異幅度Variation range平均值Mean標準差Standard deviation變異系數/%Coefficient of variationF超中親比例/%Proportion ofultra-mid parent超高親比例/%Proportion of ultra-high parent含水量/%Water content 10.0110.759.59～11.8310.720.423.8729.533??77.7846.63蛋白質含量/%Protein content 12.5612.7210.70～18.9014.711.8612.6344.511??84.5282.94面筋含量/%Gluten content22.6924.0616.93～52.5932.036.3819.91748.126??92.4690.48硬度/%Hardness48.6445.4116.41～72.2150.988.7217.10788.502??73.4166.27沉降值/mLSedimentation value17.8817.9610.40～68.4534.7713.7539.54996.946??99.6099.60

注：**表示在 0.01水平上的變異。

Note：** means variation degree at 0.01 level.

2.1.2 基于品質性狀的聚類分析 基于籽粒含水量、蛋白質含量、面筋含量、硬度和沉降值5個品質性狀對F2群體進行聚類分析，在遺傳距離為10 cM時，F2群體被分成5個類群(圖2)，其中，含水量表現為Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，蛋白質含量表現為Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ，面筋含量表現為Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ>Ⅰ，硬度表現為Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ，沉降值表現為Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ?？傮w上，類群Ⅰ單株平均沉降值最大(60.13 mL)，類群Ⅱ單株平均蛋白質含量(17.26%)、面筋含量(38.78%)最高，類群Ⅲ單株平均蛋白質含量、面筋含量、沉降值也較高，分別為16.42%、37.75%、48.24 mL；類群Ⅴ單株平均含水量(10.90%)、硬度(54.23%)最大。

圖2 寧春4號與河東烏麥雜交F2 5個類群的品質性狀

2.1.3 品質性狀的相關性分析 對F2群體的5個品質性狀進行相關性分析(表3)發現，蛋白質含量與面筋含量(r為0.94)、沉降值(r為0.93)均呈極顯著正相關，與含水量(r為-0.30)、硬度(r為-0.18)均呈極顯著負相關；含水量與硬度(r為0.49)呈極顯著正相關，與面筋含量(r為-0.29)、沉降值(r為-0.35)均呈極顯著負相關；面筋含量與沉降值(r為0.89)呈極顯著正相關；硬度與沉降值(r為-0.27)呈極顯著負相關。

表3 寧春4號與河東烏麥雜交F2品質性狀相關性分析

注： **表示在0.01水平上極顯著相關。

Note：** means significant correlation at 0.01 level.

2.2 寧春4號與河東烏麥雜交F2品質性狀分子標記分析

2.2.1 品質性狀相關分子標記輔助選擇 利用在親本間有差異的2個分別與HMW-GS數目和面粉核黃素含量相關的標記Bx17和YP7A，對其在F2群體中的分布情況進行檢測(圖3、表4)發現，331個單株中，有233個單株攜帶Bx17基因，占群體總數的70.39%；有294個單株攜帶Psy-A1基因，占總數的88.82%；有206個單株同時攜帶Bx17和Psy-A1基因，占總數的62.24%。

M：DL2000；W：空白對照；P1：寧春4號；P2：河東烏麥；1—331：F2單株M:DL2000;W:Blank control;P1:Ningchun No.4;P2:Hedong black wheat;1—331:F2 individual plants圖3 標記Bx17在寧春4號與河東烏麥雜交F2中的擴增結果Fig.3 Amplification of Bx17 in F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

標記名稱Marker name基因Genes性狀Traits株數Plant numberBx17Bx17HMW-GS數目233YP7APsy-A1面粉核黃素含量294Bx17/YP7ABx17/Psy-A1HMW-GS數目/面粉核黃素含量206

2.2.2 品質性狀的QTL定位 利用能夠在寧春4號與河東烏麥間穩定擴增的49個SSR標記對F2群體進行檢測，其中，5個標記對品質性狀有明確的QTL定位結果(表5)，這5個標記共檢測到8個與品質性狀相關的QTL，表型貢獻率為3%～5%，LOD值最大為9.40，涉及5A、1B、5B、7B、5D等5條染色體。其中，共檢測到2個蛋白質含量QTL位點，分布在2條染色體上(1B、5D)，加性效應分別為-0.42、0.23，LOD值最大為7.60；共檢測到1個含水量QTL位點，分布在7B染色體上，加性效應為-0.04，LOD值為7.20；共檢測到1個面筋含量QTL位點，分布在1B染色體上，加性效應為-1.62，LOD值為9.40；共檢測到2個硬度QTL位點，分布在2條染色體上(5A、5B)，加性效應分別為-2.93、-1.95，LOD值最大為9.40；共檢測到2個沉降值QTL位點，分布在2條染色體上(1B、5D)，加性效應分別為-2.95、1.86，LOD值最大為7.50。綜上，1B染色體上檢測到蛋白質含量、面筋含量和沉降值QTL，5D染色體上檢測到蛋白質含量和沉降值QTL，這2條染色體存在不同品質性狀的QTL富集區。

表5 寧春4號與河東烏麥雜交F2品質性狀QTL分析

3 結論與討論

長期以來，高產作為小麥育種的基本目標，要求親本具有較高產量水平[24]。高蛋白質含量是品種選育的另一要求。親本選配時要求雙親之一的蛋白質含量高，而另一親本在這方面不應過低[25-27]；蛋白質含量的遺傳力較高，變異受環境影響較小，應從早期世代開始進行選擇[28-31]。F2群體是早期世代選擇的理想群體，各遺傳性狀處于高度分離狀態，能夠提供最大的數量遺傳信息。本研究表明，5個品質性狀在F2群體中均出現較大分離，達到極顯著水平，均呈連續正態分布；蛋白質含量、面筋含量、硬度、沉降值的群體平均值均超過高親親本，超高親比例分別達82.94%、90.48%、66.27%、99.60%，含水量的群體平均值介于高親親本與低親親本之間，超中親比例達77.78%，超高親比例達46.63%；類群Ⅱ、類群Ⅲ的蛋白質含量、面筋含量和沉降值均較高，為優質類群；蛋白質含量與面筋含量和沉降值、含水量與硬度、面筋含量與沉降值均呈極顯著正相關，而蛋白質含量與含水量和硬度、含水量與面筋含量和沉降值、硬度與沉降值均呈極顯著負相關。育種實踐中，產量、品質性狀、抗病性之間往往存在負相關性，品質性狀各指標間也存在或多或少的負相關性，很難做到各個性狀都達到設定的育種目標，為此在擇優選擇的同時，還要保持各性狀間的協調性。今后還需進一步分析不同世代的品質性狀及遺傳特性，以便更準確地掌握品質性狀的變異規律。

DNA分子標記技術是根據基因組DNA存在豐富的多態性而發展起來的，可直接反映生物個體在DNA水平上的差異。分子標記為小麥品質性狀分析提供了新的遺傳標記類型。近年來，利用分子標記輔助選擇小麥蛋白質相關基因的研究已取得了一定進展[22-23,32-33]。本研究利用2個品質性狀相關標記Bx17和YP7A對F2331個單株進行檢測發現， 233個單株攜帶Bx17基因，294個單株攜帶Psy-A1基因，206個單株同時攜帶Bx17和Psy-A1基因。同時，利用新開發的5個SSR標記共檢測到8個不同品質性狀QTL位點，涉及5A、1B、5B、7B、5D等5條染色體，加性效應為-2.93～1.86，表型貢獻率為3%～5%，LOD值最大為9.40。同時，1B染色體上檢測到蛋白質含量、面筋含量和沉降值3個性狀的QTL，5D染色體上檢測到蛋白質含量和沉降值2個性狀的QTL，這2條染色體存在品質性狀的QTL富集區，可作為進一步研究的重點。本研究共檢測到蛋白質含量QTL 2個，分布于1B、5D染色體上，表型貢獻率均為4%；含水量QTL 1個，分布于7B染色體上，表型貢獻率為4%；面筋含量QTL 1個，分布于1B染色體上，表型貢獻率為5%；硬度QTL 2個，分布于5A、5B染色體上，表型貢獻率分別為5%、4%；沉降值QTL 2個，分布在1B、5D染色體上，表型貢獻率分別為3%、4%。在今后研究中，還需進一步開發高效的分子標記，通過構建高密度的物理圖譜，進而使得與品質性狀相關的QTL(尤其是主效QTL)得以精細定位，為小麥重要品質性狀QTL發掘、研究、應用奠定基礎。