利用CRISPR-Cas9基因編輯技術制備牛MSTN基因編輯胚胎

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(1.河南省農業科學院 畜牧獸醫研究所/河南省畜禽繁育與營養調控重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南農業大學 牧醫工程學院，河南 鄭州 450002； 3.鄭州外國語學校，河南 鄭州 450001)

雙肌性狀是指由于肌肉中肌纖維增多、全身肌肉總量顯著增加而形成的一種表型。動物的雙肌性狀最先在牛中被發現。牛雙肌性狀的最顯著特征是肌纖維的普遍肥大，可引起牛的肌肉質量平均增加25%。除此之外，牛雙肌性狀的優良性還表現在肌內脂肪下降約50%，肌肉的結締組織成分下降20%～30%，并且飼料消耗比下降約9%。由于雙肌性狀具有顯著的肉用優勢，所以一直是優質肉用家畜培育的一個研究熱點[1]。相關研究表明，肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)的基因功能異常是導致動物具有雙肌性狀的遺傳基礎[2-3]。MSTN是骨骼肌有效的負調控因子，研究表明，MSTN基因敲除小鼠具有由肌纖維增生和肥大引起的肌肉質量顯著增加的雙肌效應，而MSTN基因過表達小鼠則表現為極度消瘦[2,4]。目前，在牛的MSTN基因上共發現6個自然發生的功能缺陷型突變，其中nt821(del11)是在MSTN基因的編碼區缺失了第818—828位核苷酸，從而引起了MSTN蛋白失活，這是比利時藍牛的雙肌遺傳基礎；p.C313Y是在MSTN基因編碼區第938位核苷酸發生了G到A的突變，從而引起了第313位氨基酸由半胱氨酸(C)轉變為酪氨酸(Y)，最終導致蛋白質失活，這是皮埃蒙特牛的雙肌遺傳基礎[2,5]。

基因編輯技術是近年來發展起來的可以對基因組實現精確修飾的生物技術，用于在基因組水平對基因進行定點突變、插入、刪除等工作。其中CRISPR-Cas9基因編輯技術僅需要合成1條gRNA就可以實現對基因組靶位點的識別，進而實現對基因組的定點編輯。由于其簡潔高效的特性，CRISPR-Cas9技術也被稱為“基因魔剪”[6-7]。目前，包括小鼠、豬、羊等在內的多種動物，均已通過CRISPR-Cas9技術獲得了基因編輯個體，進一步證明了該技術在制備基因編輯動物上的普適性和高效性[8-11]。為了利用基因編輯技術的優勢特性以及基因工程的手段來創造新的雙肌性狀肉用家畜品種，本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術制備牛MSTN基因編輯胚胎，旨在為未來肉牛育種提供新的遺傳素材。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 供試牛卵巢樣品及胚胎培養主要試劑 供試牛卵巢共86對，均采集自鄭州市弓馬莊牛屠宰車間。TCM-199培養液、添加氨基酸的合成輸卵管液(SOFaa)、牛體外培養(Bo-IVC)液、體外成熟(IVM)基礎液、IVM液、體外受精(IVF)洗精液、IVF液配制參照文獻[11-13]。

1.1.2 陽性囊胚鑒定主要試劑 PCR試劑盒(生工生物，上海)、PCR產物純化試劑盒(天根，北京)、T7EI內切酶(NEB，北京)等。

1.2 試驗儀器

1.2.1 牛胚胎培養主要儀器 二氧化碳培養箱(Thermo，H240i)、臺式低速離心機(北京醫學儀器廠，800型)、體視鏡(Nikon，C-DS)、倒置顯微鏡(ZEISS，AXIOI)等。

1.2.2 顯微注射主要儀器 拉針儀(WPI，PUL-1)、斷針儀(NARISHIGE，MF-900)、顯微注射系統(Eppendorf，TransferMan NK 2)等。

1.3 牛卵母細胞的體外受精與受精卵的體外培養

1.3.1 牛卵母細胞的收集 共開展4次有效的牛胚胎體外培養試驗，將收集到的牛卵巢放入37 ℃、含有青鏈霉素的生理鹽水中，于4～6 h內帶回進行后續試驗。首先，用預熱的生理鹽水將收集的牛卵巢沖洗3次，去除雜質和血水，并用剪刀剔除卵巢表面的脂肪塊、結締組織和輸卵管等，再用生理鹽水將修剪后的卵巢清洗1次，將處理后的牛卵巢放于加入生理鹽水(含雙抗)的燒杯中，置于37 ℃恒溫臺上備用。然后，用10 mL注射器(帶有8號針頭)對卵巢表面直徑2～8 mm大小的卵泡內容物進行抽吸，將卵泡液移至60 mm培養皿中，體視顯微鏡下用口吸管收集卵丘-卵母細胞復合體(Cumulus oocyte complex,COC)。

1.3.2 牛卵母細胞的體外成熟 將挑選出來的COC在IVM基礎液(預先平衡2 h)中清洗3遍，在IVM液中清洗2遍，將洗凈的COC移入IVM液微滴并置于成熟盤中。然后將成熟盤置于38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的CO2培養箱中培養22～24 h，觀察牛卵母細胞成熟情況。

1.3.3 牛卵母細胞的體外受精 從液氮罐中取出凍精，放入38 ℃溫水中解凍5 s。將解凍后的精液于1 500 r/min離心5 min后，洗滌2次，棄除上清，向離心管中加入1.5 mL受精液，調整精子密度為5×106個/mL。將成熟后的卵母細胞和精子放入IVF液中，精卵共孵育8 h后完成體外受精。

1.3.4 牛受精卵在Bo-IVC液中的體外培養 精卵共孵育8 h后，用Bo-IVC液清洗3次，洗凈受精卵外圍精子及雜質后移入Bo-IVC液中，統計24 h卵裂率、144 h桑胚率及168 h囊胚率。

1.4 靶向牛MSTN基因gRNA的設計

1.4.1 靶向牛MSTN基因gRNA序列的設計 根據NCBI上牛的MSTN基因序列(登錄號：NM_001001525)，利用在線軟件(http://crispr.mit.edu/)共設計了4條gRNA(表1)。

表1 靶向牛MSTN基因的gRNA序列

注：表中劃線部分為gRNA的前間隔序列鄰近基序(PAM)。

Note：The underlined part of the table is the protospacer adjacent motif (PAM) of the gRNAs.

1.4.2 gRNA的體外合成與體外切割活性驗證 將設計好的gRNA委托北京唯尚立德生物科技有限公司(http://www.v-solid.com/)進行體外合成及體外切割活性驗證。

1.5 顯微注射

將Cas9 mRNA和驗證后體外切割活性最高的gRNA進行稀釋后混合，使混合液中Cas9 mRNA最終的質量濃度為50 ng/μL，gRNA最終的質量濃度為25 ng/μL。將混合液裝入注射針中后，使用顯微注射系統，對受精卵進行逐個注射，受精卵膨脹至原來的1.25倍時立即停止注射，注射后的受精卵置于Bo-IVC液中繼續培養168 h，然后統計囊胚率。

1.6 囊胚樣品中MSTN基因編輯效率的檢測

1.6.1 囊胚收獲 將顯微注射后的受精卵置于CO2培養箱中繼續培養，待受精卵發育至囊胚時，將囊胚置于酸性臺式液中去除透明帶，然后將去除透明帶的囊胚在TCM-199培養液中反復清洗3次，以去除酸性臺式液。

1.6.2 體外切割活性最高gRNA切割靶位點的巢式PCR擴增 首先根據巢式PCR試劑盒操作說明準備外側擴增體系，最后將去除透明帶的囊胚直接加入PCR擴增體系中作為擴增模板進行擴增。引物序列為MSTNg5BT-osF：5′-ACCCAAATGTTGCTTCTTT-3′，MSTNg5BT-osR：5′-TCCTTCTTCTCCTGGTTCT-3′，預期擴增產物長度為343 bp。外側擴增結束后，以外側擴增產物為模板，進行內測擴增，引物序列為MSTNg5BT-isF：5′-AAAGGCCCAACTGTGGATA-3′，MSTNg5BT-isR：5′-CAATGCTCTGCCAAATACC-3′，預期最終擴增產物長度為164 bp。

1.6.3 T7EI核酸內切酶檢測 使用PCR產物純化試劑盒純化擴增產物，然后將純化后的PCR產物兩兩混合，得到用于T7EI核酸內切酶檢測的樣品，將混合好的樣品進行退火后，使用T7E1核酸內切酶來鑒定樣品中發生突變的情況。酶切體系為15.0 μL：退火后的產物10.0 μL，10×Buffer2 1.5 μL，T7EI核酸內切酶1.0 μL，用超純水補至15.0 μL。將其置于37 ℃溫育1 h，然后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物。若PCR樣品中發生了基因編輯，則相鄰的2個混合樣品都會出現酶切條帶。

1.6.4 測序驗證 將T7EI核酸內切酶檢測鑒定為陽性的PCR擴增純化產物，再次進行PCR擴增后，送至生工生物工程有限公司(上海)進行測序驗證。

2 結果與分析

2.1 牛胚胎的體外培養

如表2所示，成熟的卵母細胞在體外受精后，平均卵裂率為61.18%；進一步在體外培養受精卵，統計得其平均桑胚率為24.91%，平均囊胚率為21.28%。如圖1所示，體外培養的牛COC胞質均勻且外圍顆粒細胞包裹均勻緊密，獲得的囊胚內細胞團和滋養層界限清晰，囊胚腔明顯，細胞團體積充滿透明帶內腔，表明成功實現了牛卵母細胞體外受精和體外培養。

表2 牛胚胎體外培養情況

A：體外培養的牛COC；B：體外培養168 h后獲得的牛囊胚

2.2 牛MSTN基因的gRNA序列與切割活性驗證結果

由圖2所示，對設計的4條牛MSTN基因gRNA進行切割活性驗證，結果表明，gRNA5、gRNA6、gRNA7、gRNA9的體外切割活性分別為96.00%、60.00%、93.00%、90.00%，其中，gRNA5的活性最高，可以用于進一步的胚胎驗證。

2.3 囊胚樣品中MSTN基因的編輯效率檢測結果

將獲得的330枚形態質量較好的受精卵進行顯微注射，共注射成功282枚，在體外培養中共有163枚發生卵裂，最終獲得40枚囊胚。在最終獲得的40枚囊胚中，隨機選取13枚用于MSTN基因編輯效率的檢測。由圖3所示，利用巢式PCR擴增MSTN基因gRNA5切割靶位點的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，擴增產物長度為164 bp，與預期相符合。將所得13枚囊胚樣品的PCR擴增產物兩兩混合進行T7EI內切酶檢測，結果表明，13個混合樣品中，有3個相鄰的樣品能夠檢測到酶切條帶，說明有2個PCR產物發生了基因編輯，基因編輯陽性率為15.40%(圖4)。將T7EI酶切檢測出的發生了基因編輯的PCR產物進行測序驗證，結果表明，在gRNA5靶點的下游出現了雙峰，說明在gRNA5靶點位置存在片段缺失從而造成了移碼突變(圖5)。結果表明，成功獲得了牛MSTN基因編輯胚胎。

1—4：靶向牛MSTN基因的gRNA5、gRNA6、gRNA7、gRNA9處理；5：標準陽性對照1(代表30%的切割活性)；6：標準陽性對照2(代表90%的切割活性)；7：標準陰性對照1(不添加gRNA)；8：標準陰性對照2(不添加gRNA和Cas9)；M：DL2000 DNA Marker

1—4:Treating by gRNA5,gRNA6,gRNA7,gRNA9 targeting bovineMSTNgene;5:The positive control 1 (represents 30% of cleavage activity);6:The positive control 2 (represents 90% cleavage activity);7:The negative control 1 (without gRNA);8:The negative control 2 (without gRNA and Cas9);M:DL2000 DNA Marker

圖24條靶向牛MSTN基因的gRNA的體外切割活性驗證

Fig.2Cleavageactivitydetectionof4gRNAstargetingbovineMSTNgene

1—6：抽檢的6個巢式PCR擴增產物；M：DL600 DNA Marker1—6:6 nested PCR amplification products sampled;M:DL600 DNA Marker圖3 gRNA5切割靶位點的巢式PCR擴增結果Fig.3 Nest PCR amplification results for the gRNA5 targeting site

圖4 13枚囊胚樣品中MSTN基因編輯效率的T7EI酶切檢測結果

圖5 gRNA5在牛MSTN基因上識別靶點的測序驗證

3 結論與討論

目前，牛胚胎體外生產技術的成功率已經大幅度提高，平均的囊胚率可達30%左右，但仍然存在著總體效率低、體系不穩定等問題。本研究中，牛胚胎體外培養的平均卵裂率為61.18%，平均桑胚率為24.91%，平均囊胚率為21.28%，低于國內目前的平均水平。分析原因可能是試驗次數較少，許多試驗環節還需要進一步的優化。王艷萍等[14]研究表明，添加10%的牛卵泡液對于牛卵母細胞的成熟具有顯著的提高作用，而本研究前期分析了牛卵泡液對顆粒細胞培養的影響發現，添加10%的牛卵泡液能夠顯著改善顆粒細胞的生長速度和生長狀態(未展示的結果)。除此之外，在牛胚胎體外培養過程中，胚胎細胞內容易形成活性氧基團，活性氧可以損害胚胎的體外發育。有研究表明，低氧環境組(5% O2)的囊胚發育率顯著高于高氧環境組(20% O2)[15]。由于本研究受試條件的限制，尚未嘗試使用低氧環境來培養胚胎。鑒于氧化應激對胚胎培養的損傷作用，添加適量的抗氧化應激物質，例如谷胱甘肽、吡格列酮和褪黑激素等[16-18]，也被證明能顯著提高牛胚胎體外培養的效果。因此，在未來的研究中，考慮組合添加營養物質和抗氧化應激物質，配合改善氧氣濃度，以期能夠進一步提高胚胎的體外發育效率。

CRISPR-Cas9系統被認為是目前最高效的基因編輯技術，但篩選1條能夠在體內高效切割靶位點的gRNA是提高基因編輯效率的關鍵[19]。在不同的研究中，針對不同的基因和不同的位點，所獲得的切割效率也各不相同。例如，利用CRISPR-Cas9系統定點突變豬MSTN基因的研究中，獲得的突變效率為38%，在人類293T細胞中突變AAVS1的效率為10%～25%[20]。雖然本研究中gRNA5在體外切割驗證時活性很高，可達到96.00%，但在牛胚胎中的基因編輯陽性率僅為15.40%，低于在豬上的類似研究。分析原因可能是RNA在注射時部分降解、顯微注射的RNA質量濃度或注射量需要進一步優化、供試動物體內外環境存在差異。在未來的研究中將優化試驗各步條件，以進一步提高gRNA在胚胎中的切割效率，從而提高MSTN基因編輯的效率。

胚胎移植是指將體內、體外生產的哺乳動物早期胚胎移植到同種生理狀態相同的雌性動物體內，使之繼續發育成正常個體的生物技術。胚胎移植技術在提高優秀母畜的繁殖力、加快遺傳進展、增加雙胎率、克服母畜不孕癥、降低引種費用以及減少疾病傳播等方面均具有重要價值。我國牛的胚胎移植技術目前比較成熟，凍胚的移植妊娠率為40%～50%。將本研究所得的MSTN基因編輯胚胎27枚進行凍存儲備，按照所得15.40%的陽性率，其中約包含4枚MSTN基因編輯胚胎，在未來有開展胚胎移植的合適條件下，預期能夠生產1～2頭MSTN基因編輯的“雙肌臀”牛。

本研究開展了牛卵母細胞體外受精和體外培養，結果表明，牛胚胎體外培養的平均卵裂率為61.18%，平均桑胚率為24.91%，平均囊胚率為21.28%。同時，本研究獲得多條能夠在體外高效編輯牛MSTN基因的gRNA序列，其中gRNA5的體外切割活性為96.00%。使用Cas9 mRNA和gRNA5顯微注射330枚牛受精卵后獲得40枚囊胚，檢測其中的13枚囊胚發現，有2枚中存在突變，基因編輯陽性率為15.40%。將陽性個體進行測序驗證表明，發生突變的陽性樣品在gRNA5靶位點存在片段缺失，從而造成了移碼突變。綜上，說明本研究利用CRISPR-Cas9基因編輯技術成功獲得了牛MSTN基因編輯胚胎，為我國未來的肉牛種質創新提供了素材，對我國的肉牛產業發展具有重要的意義。