流式細胞術檢測NK細胞的細胞毒作用的兩種方法比較①

蔡思齊 鄧志輝

(南方醫科大學檢驗與生物技術學院輸血醫學系,廣州510515)

自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK cell)是機體天然免疫系統的重要組成部分，與抗病毒免疫、移植免疫、自身免疫疾病及腫瘤免疫密切相關。在多種細胞因子(如IL-2、IL-15等)、飼養細胞(Feeder cells)的作用下，NK細胞可發生增殖和活化，分泌細胞因子和增強細胞毒功能。目前，NK細胞免疫治療已成為細胞免疫治療的重要方法，準確評價NK細胞的細胞毒活性，對評估病患免疫水平及細胞免疫治療效果具有重要意義。

檢測外周血或體外培養NK細胞介導的細胞毒效應，是評估NK細胞活性的主要方法，也是了解NK細胞功能最直接的方法。目前NK細胞活性檢測的主要方法有：“金標準”51Cr釋放法、LDH釋放法、MTT法等。這些方法或存在放射性污染，或易受實驗條件、操作者熟練程度干擾，重復性差；或者無法區分靶細胞和效應細胞死亡，不能很好地反映NK細胞的細胞毒功能水平。本文在已有方法的基礎上，采用流式細胞術比較鈣黃綠素乙酰甲酯(Calcein-AM)釋放法，及羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯/7-氨基-放線菌素 D(CFSE/7-AAD)雙染色法檢測體外培養后的NK細胞對K562細胞及白血病原始細胞的細胞毒活性，并對檢測結果進行分析，為NK細胞毒活性檢測提供一種較為穩定可靠、重復性好、靈敏度高的方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本來源 K562細胞株(深圳市漢科生物工程有限公司張明杰教授贈送)，白血病原始細胞留取自在深圳市血液中心進行骨髓移植HLA配型的白血病患者，NK細胞采自健康志愿獻血者。按知情同意原則，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑和儀器 X-vivo15培養液(瑞士Lonza公司)，RPMI1640完全培養液(美國Gibco公司)，人外周血淋巴細胞分離液[生工生物工程(上海)股份有限公司]，抗人 CD56、CD3抗體(美國BD Pharmingen公司)，HANK細胞體外培養試劑盒(深圳漢科生物工程有限公司)，Calcein-AM(美國Thermo Fisher公司)，CFSE、7-AAD(美國BD Pharmingen公司)，恒溫二氧化碳培養箱HF240(上海力申科學儀器廠)，TDL-400低速臺式大容量離心機(上海安亭科學儀器廠)，BD ACCURI C6流式細胞儀(美國BD Pharmingen公司)。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞分離與NK細胞培養 采集7名健康志愿獻血者靜脈血10 ml/人份，密度梯度離心分離外周血單個核細胞(PBMC)，用X-vivo15培養液重懸細胞，調整細胞密度為(1～2)×106ml-1，于37.5℃、5% CO2培養箱中平置培養13～14 d(HANK細胞體外培養試劑盒,按說明書使用)。使用抗人CD56、CD3抗體在BD ACCURI C6流式細胞儀上測定NK細胞(CD3-CD56+)含量。

1.2.2白血病原始細胞的分離與處理 4例初診、未經治療的白血病患者的骨髓樣本，采用人外周血淋巴細胞分離液分離獲得白血病原始細胞，液氮保存備用。

1.2.3兩種方法檢測7例NK細胞對不同靶細胞的細胞毒作用

1.2.3.1Calcein-AM釋放法檢測NK細胞毒作用 取培養13～14 d的NK細胞及靶細胞，洗滌去除培養液，RPMI1640培養液調整NK細胞密度，備用。

Calcein-AM標記靶細胞：取PBS以24℃、300 g離心10 min，洗滌細胞2次，調整細胞密度為1×107ml-1；加入終濃度為5 μmol/L的Calcein-AM，混勻，置于25℃、避光處孵育30 min。取出細胞，用RPMI1640完全培養液充分洗滌，并調整靶細胞密度為4×105ml-1，備用。

效-靶細胞共培養：將處理好的效應細胞與靶細胞按不同的效靶比(20∶1、10∶1)加入U形底96孔培養板中，在25℃下100 g離心1 min使細胞密切接觸。5%CO237℃培養箱，共培養4 h。設置僅NK細胞或僅靶細胞孔作為陰性對照，計算自然死亡率。

Calcein-AM釋放法靶細胞死亡率檢測：收集96孔細胞培養板中的細胞，PBS液洗滌細胞并重懸細胞。首先根據FSC和SSC確定靶細胞群，在FL-1通道，記錄共培養前后靶細胞MFI(Mean fluorescence intensity)值(MFI自發熒光、MFI標記)，再記錄效靶細胞群及陰性對照在共培養后的MFI(MFI共培養、MFI對照)；計算共培養后MFI變化值占初始熒光強度的比例，再扣除自然死亡率，即為靶細胞死亡率[1]。計算公式為：靶細胞死亡率=(MFI共培養-MFI自發熒光)/(MFI標記-MFI自發)-(MFI對照-MFI自發熒光)/(MFI標記-MFI自發)。

1.2.3.2CFSE/7-AAD雙染法檢測NK細胞毒作用 NK細胞準備同步驟1.2.3.1。CFSE/7-AAD法標記靶細胞：用DPBS液洗滌細胞2次，調整細胞數量為1×107個/ml。加入CFSE(美國BD Pharmin-gen公司)，終濃度為2.5 μmol/L，混勻后置于37℃水浴箱中，避光孵育10 min。取出細胞，用含有10%FBS的冷 RPMI1640充分洗滌。RPMI1640完全培養液重懸細胞，調整靶細胞密度為4×105ml-1，備用。效靶細胞培養及陰性對照設置同步驟1.2.3.1。

CFSE/7-AAD法靶細胞死亡率檢測：收集96孔細胞培養板中的細胞，PBS液洗滌細胞2次，重懸細胞，加入4 μl 7-AAD標記死亡細胞，混勻，室溫避光孵育20～25 min。PBS液洗滌1次。根據FSC和SSC確定靶細胞群，對CFSE+細胞進行設門，分析該細胞群中 CFSE+/7-AAD+雙陽性細胞所占比率即為靶細胞死亡率。計算公式：靶細胞死亡率=殺傷后靶細胞死亡率-靶細胞自然死亡率。

1.3統計學處理 采用SPSS22.0對實驗結果進行獨立樣本t檢驗分析，方差不齊時使用Cochran&Cox近似t檢驗(t′檢驗)。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1NK細胞培養結果 初始培養時NK細胞占PBMC的比例僅為(11.76±3.55)%，自第5天開始增加，至培養第13天，NK細胞比例增至(83.65±3.18)%(表1)。對培養過程中的NK細胞比例變化進行線性回歸分析，決定系數R2=0.928，經F檢驗P=0.000 5，差異具有統計學意義；回歸系數b=0.644，對b進行t檢驗，P=0.000 5，NK細胞純度與培養時間存在直線關系，隨著培養時間的增加，其NK細胞比例隨之增加。

2.2Calcein-AM及CFSE對靶細胞的標記結果 在前述工作濃度下，Calcein-AM及CFSE均能對密度為1×107ml-1的靶細胞進行有效標記，二者對靶細胞的標記率均可達99%以上。在FL-1通道上能夠顯著地與NK細胞的自發熒光峰進行區分(圖1)。

2.3培養第13天的NK細胞對靶細胞的細胞毒活性 NK細胞對K562細胞的細胞毒活性(表2)：在對K562細胞的殺傷中，隨著效靶比的增高，兩種方法檢出NK細胞的細胞毒活性均增高。但在效靶比20∶1時，CFSE/7-AAD法檢出的靶細胞死亡率高于Calcein-AM釋放法(圖2)，但差異無統計學意義(P>0.05)；在效靶比10∶1時，NK的細胞毒作用減弱，CFSE/7-AAD法(圖3A～C)所檢測出的細胞毒性高于Calcein-AM釋放法(圖2A～D)，差異具有統計學意義(P<0.05)。

NK細胞對白血病原始細胞的細胞毒活性(見表2)：本文從4名白血病患者中分離的白血病原始細胞占有核細胞的比例為(91.00±1.83)%。在對白血病原始細胞的殺傷實驗中，CFSE/7-AAD檢出的細胞毒性顯著高于Calcein-AM釋放法(P<0.05)。 在對3、4號患者白血病原始細胞的實驗中，NK細胞的細胞毒作用弱，Calcein-AM釋放法中FL-1上MFI改變不顯著，盡管能夠計算靶細胞死亡率，但結果不準確、誤差大(圖2E～H)，而CFSE/7-AAD能夠靈敏地檢出較弱的細胞毒作用(圖3D～F)，與Calcein-AM法比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。兩種方法所檢測的各組靶細胞自然死亡率差異不具有統計學意義(P=0.45，P=0.81)。

圖1 靶細胞經Calcein-AM或CFSE標記前后FL-1通道上熒光強度變化及NK細胞自發熒光

表1NK細胞體外培養的純度變化(n=7)

Tab.1PurityofNKcellsduringvitroexpansion(n=7)

Duration of NK cells vitro expansion0 d3 d5 d7 d9 d11 d13 dParameters of linear regressionbPPurity of NK cells(%,x±s)11.76±3.556.22±2.8926.05±5.5638.40±7.5761.20±10.3573.91±6.7083.65±3.180.6440.0005

Target cellsDiagnosisK562-1#ALL2#AML3#AML4#AML10∶1Calcein-AM44.29±9.189.50±3.5014.16±6.552.07±0.692.96±1.81CFSE/7-AAD55.59±5.2528.22±5.4331.67±5.015.72±1.3111.59±4.63P-value0.010.000 010.000 10.000 30.000 220∶1Calcein-AM55.40±11.4023.16±4.8122.32±5.903.44±0.954.65±2.24CFSE/7-AAD61.14±7.6633.66±3.5237.30±2.409.69±2.5514.63±4.46P-value0.200.00 10.000 040.000 10.001

圖2 Calcein-AM 法釋放法檢測NK細胞對K562細胞和白血病原始細胞的細胞毒作用

Note：1#，2#，3#，4# represent the leukemia blast isolated from 4 different leukemic patients at diagnosis.

3 討論

本文中，隨機健康獻血者外周血PBMC中NK細胞含量僅有(11.76±3.55)%。其他針對不同地區中國人群外周血NK細胞含量的研究表明，隨機人群外周血PBMC中NK細胞含量僅有(7.35～15.21)%[2-4]。本文對PBMC進行擴增，可獲得純度較高的NK細胞群，既滿足本實驗對細胞數量的要求，也可避免大量采血，減少對患者的負擔。

Calcein-AM被用于真核細胞活力測定、細胞示蹤，近年有文獻報道將其用于細胞毒作用檢測，能夠替代51Cr釋放法，重復性好、操作簡便且更加精確[5-7]。 Calcein-AM能夠透過細胞膜，在酯酶水解作用下產生Calcein并發出熒光。由于凋亡細胞和死細胞的細胞膜被破壞，Calcein釋放，細胞群熒光強度減弱，MFI減低，因而能用于細胞毒作用的檢測。但Calcein-AM釋放法原理與51Cr釋放法相似，因此存在一些51Cr釋放法的缺陷。51Cr釋放法及Calcein-AM都是基于整體水平的檢測，無法檢出單細胞水平的殺傷。并且二者標記細胞都依賴于細胞質的作用，難以標記一些細胞質含量少的細胞，如Daudi細胞和Raji細胞，且從細胞死亡至標記物從釋放有時間差[8]。前述因素導致了51Cr釋放法及Calcein-AM的適用范圍受到限制、靈敏度降低。

CFSE廣泛地用于細胞示蹤和細胞增殖研究，同時也用于細胞毒活性的測定[9-11]。CFSE能夠穿過完整的細胞膜，在胞內產生羧基熒光素分子，發出熒光。因此CFSE能夠非特異性地標記整群活細胞，不需要依賴特異性抗原-抗體反應，適用的靶細胞范圍廣，且在細胞中熒光維持時間長、不易衰減。7-AAD是一種核酸染料，正常情況下，它不能通過正常細胞膜。隨著細胞凋亡、死亡，細胞膜對7-AAD的通透性逐漸增加，使之結合細胞凋亡中的DNA，在合適波長激發光的激發下發出明亮的紅色熒光。且7-AAD具有發射波譜較窄，對其他檢測通道的干擾小的特點，適于多色熒光分析。CFSE及7-AAD二者聯合使用，能夠在單細胞水平上檢測效應細胞的死亡率，實驗靈敏度高，穩定性好。

在兩種方法對靶細胞標記上，Calcein-AM及CFSE均能非特異性地快速標記靶細胞，對靶細胞的標記率高，熒光強度強，在FL-1通道上能顯著地與效應細胞區分。在檢出NK細胞對不同靶細胞的細胞毒作用實驗中，靶細胞死亡率隨著效靶比的增加而升高。但CFSE法檢出在不同效靶比、不同靶細胞的死亡率高于Calcein-AM釋放法。

在對K562細胞的實驗中，20∶1的效靶比下，Calcein-AM與CFSE法檢出的死亡率分別為(55.40±11.40)%和(61.14±7.66)%，CFSE法檢出率高于前者，差異不具有統計學意義(P=0.20)；但在10∶1組中，二者檢出的死亡率則為(44.29± 9.18)%和(55.59±5.25)%，差異具有統計學意義(P=0.01)，CFSE/7-AAD法較為敏感。

HLA Ⅰ 類抗原與NK細胞表面的殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(Killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)分子相配位，共同調節NK細胞的活性。由于K562細胞缺乏與KIR相配位的HLA Ⅰ類抗原表達[12,13]，KIR分子對NK細胞的抑制作用完全被解除，NK細胞被激活。文獻報道從白血病患者體內新分離的白血病原始細胞表面的HLA Ⅰ類抗原選擇性下調[14,15]，NK細胞的抑制作用部分解除。因此NK細胞對K562細胞株的細胞毒作用較強，而對白血病原始細胞的細胞毒作用則受HLA Ⅰ類抗原下調水平的影響，不同程度地減弱。本實驗中，兩種方法所檢出的NK細胞對不同白血病原始細胞的細胞毒作用，均較K562弱。在檢測4株不同患者來源的白血病原始細胞中，CFSE法在10∶1和20∶1的效靶比下，檢出的靶細胞死亡率均高于Calcein-AM釋放法，各組中差異均具有統計學意義 (P<0.05)，詳見表2。但在細胞死亡率較低時，Calcein-AM釋放法的MFI變化微弱，不能準確地計算出相對變化值，對靶細胞死亡率的計算不準確。但CFSE法則可以通過對實驗細胞群中對CFSE+7/AAD+細胞進行分析，直觀的呈現靶細胞死亡率，不依賴MFI變化。

以往研究者報道的靶細胞標記方法，如：張嘉等[16,17]對靶細胞進行增強熒光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP)標記，借由EGFP在FL-1通道的熒光來區別靶細胞與效應細胞。但該法需要預先對細胞進行轉染，使靶細胞攜帶有EGFP基因，進而表達熒光蛋白。此法延長了實驗周期，對于新分離的白血病原始幼稚細胞而言，體外培養則可能引發表型改變，與患者體內的白血病原始幼稚細胞存在差異。Ozdemir等[18]利用K562白血病原始幼稚細胞系表達CD33這一細胞表面抗原，使用抗CD33特異性熒光抗體對靶細胞進行標記，進而在CD33+細胞群中分析靶細胞死亡率。但對于一些不表達細胞表面特異性標志物的腫瘤細胞，抗體標記法并不適用；且抗體標記法的標記強度取決于靶細胞表面抗原表達密度，標記某些在細胞表面表達較少的特異性抗原時，則難以很好地標記靶細胞。

綜上所述，本文比較了Calcein-AM釋放法及CFSE/7-AAD雙染色法，在不同效靶比分別對K562細胞株和不同患者來源的白血病原始細胞進行了細胞毒實驗結果。兩種染色方法均能對不同的靶細胞進行有效標記和區分；在較高的效靶比和較強的細胞毒作用(如：對K562細胞)下，兩種方法對靶細胞死亡率檢出的差異不具有統計學意義；但在細胞毒作用較弱的情況下，CFSE/7-AAD雙染法檢測白血病原始細胞的死亡率優于Calcein-AM單染法，具有重復性好、操作簡便、靈敏度高等特點。