陜西楊凌地區番茄斑萎病毒外殼蛋白基因的克隆與分析

默 寧石 巖秦 蕾李云洲梁 燕*

（1西北農林科技大學園藝學院，陜西楊凌712100；2貴州大學農學院，貴州貴陽550025）

番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）屬于布尼亞病毒目（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒科（Tospovirus）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus），被列為世界十大植物病毒之一（Rosel ló et al.，1996；Ullman et al.，2005），最早于1915年在澳大利亞被發現（Brittlebank，1919）。該病毒寄主植物廣泛，可侵染84個科1 090種植物。TSWV可系統侵染整株植株，進而導致發病。該病毒的傳播介體主要是西花薊馬以持久循環增殖型傳播方式傳播，傳播介體一旦感染該病毒，便會終身帶毒（鄭雪 等，2013；李云洲 等，2018）。TSWV已在巴西、阿根廷、法國、西班牙、意大利、澳大利亞、美國等國家的番茄生產中造成了嚴重損失（Jones，2005）。我國于2003年檢測出TSWV（Soler et al.，2003），之后隨著TSWV危害范圍逐年擴大，在四川、云南、廣州、山東、河北等地多種園藝植物上均有發現（丁銘 等，2004；張友軍 等，2004；Dong et al.，2008；饒雪琴 等，2010；方琦 等，2011；邱樹亮 等，2012；鄭雪 等，2013）。目前，TSWV在云南等地分布廣泛，危害也日趨嚴重，大棚和溫室番茄均有受損，嚴重時產量損失超過80%，甚至絕收（方琦 等，2011）。

陜西楊凌是我國唯一一處國家級農業高新技術產業示范區，番茄為楊凌地區的主要蔬菜作物。為了了解TSWV在楊凌地區的發病情況以及致病病毒類型，于2016年4～7月在番茄主要栽培示范基地進行調查取樣，收集了疑似感染TSWV的番茄樣品4份，進行分子鑒定，明確楊凌地區TSWV病毒株系，為楊凌地區番茄TSWV鑒定以及抗TSWV育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 選取楊凌地區感病番茄植株上部幼嫩葉片，錫箔紙包裹后置液氮冷凍5 min后于-80℃超低溫冰箱中保存備用。

1.1.2 載體與菌株 pMD18-T購于大連寶生物工程有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 試驗方法

2016年4～7月于楊凌區新天地設施大棚中設點觀察番茄感染TSWV的癥狀。采集疑似感病材料發病葉片，液氮速凍，提取葉片RNA，利用TSWV外殼蛋白基因（CP）的特異性引物（F：5′-TCTGTGAGGCTTGCCATAAT-3′；R：5′-A GCATACTCTTTCCCTTTCT-3′）對田間疑似發病葉片進行PCR鑒定。

1.3 楊凌地區TSWV CP基因克隆測序及分析

利用已檢測出的陽性材料進行TSWV CP基因的全長克隆，PCR擴增引物為F：5′-ATGTYTAAGGTTAAGCTCACTAAG-3′；R：5′-TT AAGCAAGYYCTGYGAGTTTTGCC-3′，將 PCR 產物送往西安擎科生物公司進行測序，利用DNAMAN 6.0軟件對測序所得序列進行比較分析；為了分析楊凌地區TSWV番茄分離物系統進化關系及分類地位，與已有的TSWV分離物，基于TSWV CP基因序列，采用MEGA 5.0軟件以鄰接法構建系統發育進化樹，各分支置信度（bootstrap）進行1 000次重復分析。

2 結果與分析

2.1 番茄TSWV的田間癥狀觀察

番茄感染TSWV后，初期葉片開始有不太明顯的深色病斑（圖1-B），隨著病斑面積的擴大，葉片開始發黃壞死；進而植株的莖上也出現病斑（圖1-A），開始時期零星分布，隨著癥狀的發展，病斑連成一片，整棵植株長勢越來越弱；綠熟期果實出現明顯病斑，表面凹凸不平（圖1-C），紅熟期果實也有古銅色斑點出現（圖1-D）。

圖1 楊凌地區設施番茄感染TSWV后的癥狀表現

2.2 楊凌地區番茄TSWV鑒定結果

用TSWV CP基因的特異性引物對4份供試樣品進行PCR檢測，其中2份樣品擴增到約234 bp的特異性條帶（圖2-A），經測序后比對，這2份陽性樣品擴增出的特異條帶序列與GenBank中的TSWV序列相似性均達到98%以上，表明所擴增到的基因片段屬于TSWV。

圖2 楊凌地區TSWV鑒定（A）及其CP基因的克?。˙）

2.3 楊凌地區TSWV CP基因的克隆與測序

選取TSWV檢測為陽性的番茄樣品，采用同源克隆方法擴增TSWV的CP基因全長，得到目的片段（圖2-B），并對目的片段進行回收，連接pMD-18T，熱激轉化進大腸桿菌（Escherichia coli，Top10），測序后獲得757 bp的TSWV CP基因（圖3），ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。

2.4 楊凌地區TSWV CP基因序列的同源性分析

圖3 楊凌地區TSWV CP全基因序列

從表1可以看出，楊凌地區TSWV與西班牙TSWV（FR693089.1）CP基因的同源性最高，達到99%；與阿爾及利亞TSWV（FR693045.1）的同源性為90%；與夏威夷TSWV（X61799.1）、中國臺灣（HM180089.1）、美國（HQ406983.1）、澳大利亞（AY879109.1）、新西蘭（KC494503.1）、土耳其（KM379142.1）、中國云南（KC294570.1）的同源性在79%～86%之間；而與中國昆明TSWV（HQ402595.1）、 韓 國（HM581936.1）、 朝 鮮（KC261949.1）的同源性僅為15%～16%。

從氨基酸序列比對結果可以看出（圖4），除 了 中 國 昆 明 TSWV（HQ402595.1）、 韓 國（HM581936.1）、朝鮮（KC261949.1）外，楊凌地區TSWV與其余9個地區的TSWV氨基酸序列的保守區域基本一致?？缒し治鼋Y構顯示（圖5），楊凌地區TSWV的外殼蛋白具有1個跨膜結構，位于95～122個氨基酸之間。

表1 楊凌地區TSWV與NCBI中12個TSWV CP基因序列的同源性

圖4 13個TSWV外殼蛋白氨基酸序列比對結果

2.5 系統進化樹分析

系統發育進化樹顯示（圖6），楊凌地區番茄樣品的TSWV序列與西班牙TSWV分離物（FR693089.1）處于同一分支，親緣關系最近，并且二者與阿爾及利亞分離物（FR693045.1）處于同一大支，親緣關系較近；而楊凌地區TSWV番茄分離物與云南昆明的TSWV分離物親緣關系較遠，昆明TSWV分離物與韓國TSWV分離物的親緣關系較近。

圖5 TSWV蛋白跨膜區的預測結果

圖6 基于CP基因序列構建的楊凌地區TSWV分離物及其相關分離物的系統進化樹

3 結論與討論

TSWV在我國出現較晚，但隨著西花薊馬的傳播，危害范圍逐漸擴大，危害也日趨嚴重（方琦 等，2011），由于地理環境差異，該病毒種類多，親緣關系復雜。目前關于番茄抗TSWV的標記有9個，分別為 Sw-1a、Sw-1b、Sw-2、Sw-3、Sw-4、Sw-5、Sw-5b、Sw-6、Sw-7（Finlay，1952，1953；van Zijl et al.，1986；Stevens et al.，1991；Canady et al.，2001；Lee et al.，2015），在育種中應用較多的為Sw-5。由于病毒NSs基因突變可以造成Sw-5抗性消失（Jiang et al.，2017），因此了解當地病毒基因序列十分關鍵。本試驗通過分子鑒定獲得了楊凌地區TSWV的CP基因序列，為當地番茄抗病育種提供了基礎。

國內外已有不少關于番茄斑萎病毒基因克隆及序列比對分析的研究（方琦 等，2011；尹躍艷 等，2013），尹躍艷等（2013）對21個TSWV昆明分離N基因序列進行克隆分析，系統進化分析發現昆明分離物與韓國分離物的親緣關系很近，而本試驗中楊凌地區的TSWV分離物CP基因與西班牙番茄上的TSWV分離物親緣關系更近，而與昆明的TSWV分離物的親緣關系較遠?？梢姴煌貐^的TSWV存在差異。

當前TSWV在我國各地普遍發生，而我國對于TSWV的研究仍處于起步階段。應首先從研究當地TSWV病毒類型入手，選育適應當地TSWV病毒類型的抗病品種，挖掘新的抗病基因，增加番茄抗TSWV基因的儲存量，使抗病基因多樣化以適應不同地區的TSWV病毒類型，這對我國番茄TSWV抗性育種工作的開展具有積極意義。