凍融循環對南極磷蝦蝦肉糜滋味成分的影響*

潘曉煬 楊林莘 王曉燕 金銀哲① 程裕東

(1.上海海洋大學食品學院 上海 201306；2.食品熱加工工程中心 上海 201306； 3.國家級食品科學與工程實驗教學示范中心 上海 201306)

南極磷蝦(Euphausia superba)被認為是一種豐富的蛋白質來源，總生物量估計為3.79億t，其可利用生物量與人類目前捕獲的其他水生生物的總生物量相當(Atkinsonet al,2009; 聶玉晨等,2016)。南極磷蝦作為食品進行開發利用面臨一些問題，如外骨骼中高含量的氟化物對人體健康有潛在危害；另外，磷蝦體內高活性的內源酶會引起死后的快速自溶，從而導致腐敗(Anhelleret al,1989)。Boonsumrej等(2007)提出捕獲后的磷蝦應立即進行冷凍處理，以獲得更好的品質。冷凍可以有效延緩磷蝦的自溶，同時抑制微生物作用，在磷蝦加工中得到了廣泛的應用。

食品及其原料的凍融循環通常發生在零售場所、餐館和家庭日常消費過程中(Aliet al,2015)。在蝦和其他水產品的冷凍貯藏過程中，脂質氧化、蛋白變性、冰晶的升華和重結晶，是引起品質變化的主要原因(Londahl,1997; 曹榮等,2016)。在解凍過程中，水產品原料的品質會進一步劣化，這主要取決于解凍方式、解凍速率和凍融次數(Srinivasanet al,1998)。微波解凍比傳統解凍更快速、更均勻，對組織的破壞更小，汁液損失更低，同時可以控制微生物的生長繁殖(郭潔玉,2015)，因而在食品工業和家庭消費中的應用越來越普遍。

反復冷凍和解凍會加速食品原料的品質劣化(Aliet al,2015; 戚軍,2009)。如Sriket等(2007)發現凍融循環會加劇斑節對蝦(Penaeus monodon)和凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)蛋白質變性和肌纖維損傷。此外，凍融循環還會加劇對蝦的脂質氧化和質構劣化(Boonsumrejet al,2007)。目前，關于冷凍和微波解凍循環對南極磷蝦風味影響的報道還很少。本研究通過分析南極磷蝦蝦肉糜在反復冷凍和解凍過程中ATP及其關聯產物、游離氨基酸的變化，探究凍融循環對南極磷蝦蝦肉糜滋味成分的影響，為南極磷蝦的高效加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

冷凍的南極磷蝦蝦磚(250 g/塊)購于山東青島大康尚品商貿有限公司；三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP)、腺苷酸(Adenosine monophosphate，AMP)、肌苷酸(Inosine monphosphate,IMP)、次黃嘌呤核苷(Hypoxanthine riboside,HxR)和次黃嘌呤(Hypoxanthine,Hx)標準品以及氨基酸標準品購于美國Sigma公司；甲醇、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaOH、NaCl為色譜純，其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

E2695高效液相色譜儀 美國沃特世股份有限公司；L-8800氨基酸全自動分析儀日立(中國)有限公司；OSR-8微波工作站 松下電器集團有限公司；Avanti J-26S高效離心機 貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司；FSH-2可調高速勻漿機 常州國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 南極磷蝦蝦肉糜的制備 南極磷蝦蝦磚常溫條件下流水解凍30 min，去除表面多余的水分。取適量的南極磷蝦放入研磨機中進行斬拌，每隔1 min斬拌1次，轉速為10000 r/min，共斬拌3 min。將斬拌后的蝦肉糜填入外徑22 mm、內徑20 mm、高15 mm的模具中，用封口膜密封。

1.3.2 冷凍和微波解凍處理 將樣品放于-20℃冰箱中凍藏7 d后取出解凍，再放入冰箱凍藏，重復 5次，實驗周期共35 d。樣品從冰箱取出后，均在微波工作站中解凍。微波功率設置為150 W，解凍時通過光纖傳感器來監測樣品中心溫度，樣品中心溫度達到(4±0.5)℃作為解凍終點。

1.3.3 ATP及其關聯產物的分析 參考贠三月等(2017)的方法并略作修改。準確稱量5.0 g凍融循環后的蝦肉糜樣品，加入10% HClO420 ml，均質后在4℃條件下10000 r/min離心10 min，取上清液。在沉淀中繼續加入5% HClO410 ml，重復上述操作。離心后將2次上清液合并，用KOH溶液調pH至5.8，定容到50 ml，用0.22 μm水相濾膜過濾后采用高效液相色譜儀進行分析。

高效液相色譜法的測試條件為：島津ODS-3 C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為30℃；流動相溶液A為KH2PO4和K2HPO4混合液，溶液B為甲醇；采用等梯度洗脫，流速為1.0 ml/min；進樣量為10 μl；檢測波長為254 nm。

1.3.4 鮮苦比的計算 參考Zhang等(2018)的方法，計算公式如下：

式中，IMP、HxR和Hx為各呈味核苷酸含量(μmol/g)。

1.3.5K值的計算 參考Saito等(1959)的方法，計算公式如下：

式中，ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx為各核苷酸含量(μmol/g)。

1.3.6 游離氨基酸的測定 參考王曜等(2014)的方法并略作修改。準確稱量2.0 g凍融循環后的蝦肉糜樣品，加入0.02 mol/L的稀鹽酸20 ml，均質5 min后，在4℃條件下5000 r/min離心10 min，取上清液定容至50 ml。取2 ml上述溶液加入50 ml離心管中，同時加入5%的磺基水楊酸2 ml，在4℃條件下 10000 r/min離心10 min，取上清液經0.22 μm水相濾膜過濾后，進氨基酸全自動分析儀進行測定。

1.3.7 滋味活性值(TAV)的計算 參考喬方等(2013)的方法，計算公式如下：

1.4 數據處理

采用Origin 8.3繪制圖表，顯著性分析采用SPSS 21.0，結果采用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與討論

2.1 南極磷蝦蝦肉糜在凍融過程中ATP及其關聯產物變化

圖1是凍融循環對南極磷蝦蝦肉糜ATP及其關聯產物的影響。ATP的主要功能是為細胞提供能量(劉旭等,2008; 湯水粉等,2014)。水產動物死前掙扎程度、死后貯藏溫度和條件等都會影響ATP的降解速度(?zogulet al,2010)。ADP、AMP、IMP、HxR、Hx等都是ATP分解后的關聯化合物。IMP是呈鮮味的核苷酸(Xiet al,2016)。HxR和Hx可以產生苦味。1次凍融對應的AMP和IMP的含量相對較高，分別是2.79 μmol/g和2.92 μmol/g。在第2次凍融循環后，IMP含量顯著下降(P＜0.05)，從2.92 μmol/g下降至0.39 μmol/g，而AMP含量則增加至3.83 μmol/g。凍融循環3次后，IMP的含量無明顯變化，AMP的含量則顯著降低(P＜0.05)。HxR的含量隨凍融次數呈現逐漸增加的趨勢，在凍融循環4次后達到最大值5.53 μmol/g。凍融2次對應的Hx含量有明顯增加，之后隨凍融次數的增加變化不大。HxR和Hx的積累是自溶與微生物作用的結果(Pacheco-Aguilaret al,2008)。

圖1 凍融循環對南極磷蝦蝦肉糜ATP 及其關聯產物的影響 Fig.1 Effects of freezing and thawing cycles on nucleotide related compounds of minced Antarctic krill

鮮苦比可表征凍融循環對南極磷蝦蝦肉糜滋味的影響。由圖2可以看出，隨著凍融次數的增加，呈苦味的核苷酸比例增大，1次凍融對應的鮮苦比為3.32，2次凍融對應的鮮苦比僅為0.16，差異極為顯著(P＜0.01)。

K值是評價水產品新鮮度的常用指標。一般而言，K值越小表明水產品越新鮮(方藝達等,2017)。剛捕獲的水產品K值一般不超過10%，貯藏前期K值的增加主要是酶作用下ATP發生降解，隨后K值的迅速增加則主要是微生物作用的結果(Morzelet al,2003)。Saito等(1959)認為水產品K值＜20%表明非常新鮮，K值＜50%時可以接受，K值＞70%時表明已失去商品價值。圖2是凍融循環期間南極磷蝦蝦肉糜鮮苦比和K值的變化情況。隨著凍融循環次數的增加，K值從12%增加到88%，4次凍融循環后南極磷蝦已不新鮮，這主要是HxR含量增加的結果。Lee等(2016)發現凍融循環次數的增加，加速了氧化三甲胺脫甲基酶的釋放和積累，加速了蛋白質的變性和聚集，由此導致魚類肌肉的品質進一步劣化。

圖2 凍融循環期間南極磷蝦蝦肉糜鮮苦比和K值的變化 Fig.2 Changes in flavor/bitter ratio and K value of minced Antarctic krill during freezing and thawing cycles

2.2 南極磷蝦蝦肉糜在凍融過程中游離氨基酸含量變化

由表1可知，南極磷蝦蝦肉糜中共檢測到16種游離氨基酸，甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、精氨酸和脯氨酸含量相對較高。隨著凍融次數的增加，蝦肉糜中游離氨基酸的總含量逐漸增加，這與Zhou等(2011)的研究結果基本一致，這可能與凍融循環期間蛋白質持續發生降解有關(Mesiaset al,2016)。陳茜茜等(2014)發現凍融循環次數的增加促進了牛肉蛋白質的氧化與降解，降低了牛肉的嫩度和保水性。此外，凍融循環期間蝦肉糜中游離氨基酸主要是甜味氨基酸和苦味氨基酸，鮮味氨基酸比例較低。隨著凍融次數的增加，甜味氨基酸比例逐漸減小，而苦味氨基酸的比例有所增大。

TAV是單一的滋味活性物質的濃度與其閾值的比值，TAV＞1時，數值越大，對滋味的貢獻越大(喬方等,2013)。由表2可知，凍融循環期間16種游離氨基酸中TAV值＞1的氨基酸有6種，分別為甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸。甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸是呈甜味的氨基酸，賴氨酸、組氨酸和精氨酸是呈苦味的氨基酸(曹榮等,2018)。在凍融循環期間，南極磷蝦蝦肉糜中3類呈味氨基酸的總TAV值大小順序為：苦味＞甜味＞鮮味，說明蝦肉糜中苦味氨基酸對滋味的貢獻較大。

表1 凍融循環期間南極磷蝦蝦肉糜中游離氨基酸的含量 Tab.1 Free amino acids contents of minced Antarctic krill during freezing and thawing cycles(mg/g)

表2 凍融循環期間南極磷蝦蝦肉糜中游離氨基酸的TAV值 Tab.2 Taste activity values of free amino acids in minced Antarctic krill during freezing and thawing cycles

3 結論

凍融循環對南極磷蝦蝦肉糜的滋味成分有顯著的影響。隨凍融循環次數的增加，ATP及其關聯產物降解加劇，呈鮮味的核苷酸含量逐漸減少，呈苦味的核苷酸含量逐漸增加；甜味氨基酸比例逐漸減小，而苦味氨基酸的比例逐漸增大。因此，在工業化生產和家庭日常消費時，為了使南極磷蝦蝦肉糜保持較好的品質，應盡可能減少凍融循環次數，一般應控制在 2次以內。