基于線粒體細胞色素b基因序列的新安江流域溫州光唇魚群體遺傳研究*

周華興 胡玉婷 段國慶 凌 俊 江 河 潘庭雙

(安徽省農業科學院水產研究所 合肥 230031)

新安江源于黃山南麓，流域上游多為山間溪流，地勢復雜，水流湍急。下游東入浙江省西部，經淳安至建德與蘭江匯合后為錢塘江。溫州光唇魚(Acrossocheilus wenchowensis)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、光唇魚屬(Acrossocheilus)(Nelsonet al,2016)，是新安江流域中上游棲息的淡水型魚類，在浙江、廣東、福建境內也有分布。因其成魚常棲息于石縫間，體側具有多條鮮艷的黑色橫斑而被地方稱為“石斑魚”。由于溫州光唇魚肉質細嫩、體色鮮艷，具有較高的食用和觀賞價值，深受消費者的青睞(冀德偉等,2009)。近年來，受水質污染、棲息地破壞、過度捕撈等人類活動的影響，新安江流域溫州光唇魚的野生資源急劇減少，其分布范圍日益減縮，資源數量逐漸下降，個體規格也越來越小(胡玉婷等,2017)。因此，開展新安江流域溫州光唇魚群體遺傳結構研究和保育工作已迫在眉睫。

由于具有高突變率、低重組率及嚴格的母系遺傳等特征，線粒體基因序列一直是群體遺傳學和系統發生學研究中的理想標記(Cannet al,1987)。馬春艷等(2009)采用線粒體細胞色素b基因(Cytb)對鯧屬3種魚類系統進 化關系進行分析，提出銀鯧(Pampus argenteus)是3種鯧屬魚類中較早分化出的種，而刺鯧(Psenopsis anomala)則是鯧屬魚類的原始類群的觀點。李大命等(2017)利用線粒體Cytb和細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因作為分子標記，分析洪澤湖大銀魚(Protosalanx hyalocranius) 40個個體的序列多態性，提出該群體可能經歷種群擴張事件，且單倍型未出現遺傳分化。張爭世等(2017)基于線粒體Cytb基因探討齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)野生群體的遺傳多樣性和遺傳結構，長江上游4個齊口裂腹魚野生群體未經歷過種群擴張，且群體間和群體內存在顯著的遺傳分化。

本研究采用線粒體Cytb基因，探討新安江流域 的6個不同溫州光唇魚地理群體的遺傳結構，并重建其群體進化歷史，以期為該類魚種的保育和開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

實驗所用的溫州光唇魚樣本于2016年10月～ 2017年8月采集自新安江流域。6個自然群體分別采自畢村(BC)、杞梓里(QZL)、南塘(NT)、上豐(SF)、北岸(BA)、朱家坑(ZJK)，共170個個體(表1，圖1)。樣本采集后做好標記，保存于95%的酒精中固定。

表1 溫州光唇魚樣本采集信息 Tab.1 Sampling information of A.wenchowensis

圖1 溫州光唇魚6個群體樣本采集點 Fig.1 Sampling sites of 6 populations of A.wenchowensis

1.2 基因組DNA提取

取樣本背部肌肉組織，采用Sambrook法提取基因組DNA(Sambrooket al,1989)。

1.3 PCR擴增及測序

Cytb基因的擴增和測序引物為H15915(5′-CTC CGATCTCCGGATTACAAGAC-3′)和L14724(5′-GAC TTGAAAAACCACCGTTG-3′)(Xiaoet al,2001)。

PCR反應體系：200 ng的模板DNA，10×Buffer緩沖液(TaKaRa) 5 μl，dNTP(2.5 mmol/L) 3 μl，MgCl2(2.5 mol/L) 4 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2 μl，TaqDNA聚合酶0.75 U，補充無菌超純水至50 μl。

PCR反應條件：96℃預變性1 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，共34個循環；72℃延伸10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程(上海)有限公司雙向測序。

1.4 數據分析

所得序列通過Seqman軟件(Burland,2000)輔助人工進行拼接組裝，獲得完整的mtDNA Cytb基因。序列集通過MAFFT v.7(Katohet al,2013)在線比對，并輔以人工校正。采用DNAsp 5.0(Libradoet al,2009)計算多態位點、單倍型數目、錯配分布(Mismatch distribution)、單倍型多樣性(Haplotype diversity,Hd)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity,Pi)。使用Network 5繪制單倍型網絡關系圖。通過MrBayes3.1.2(Ronquistet al,2003)采用貝葉斯法(Bayesian inference,BI)構建單倍型系統進化樹。使用MEGA 6(Tamuraet al,2013)(Kumara2-parameter)計算種群遺傳距離，并通過Arlequin 3.11(Excoffieret al,2005)計算種群遺傳分化指數(F-statistics,Fst)并進行分子變異分析(Analysis of molecular variance,AMOVA)。使用Beast1.6軟件包(Drummondet al,2007)進行貝葉斯天際線(Bayesian skyline plot,BSP)分析，檢測種群變化的歷史動態?；诰垲悩涞耐負鋵W結構，使用RASP 3.0軟件(Yuet al,2015)重建溫州光唇魚祖先種群起源地，追溯其原種群。

2 結果與分析

2.1 序列特征和遺傳多樣性分析

測序獲得的170條溫州光唇魚mtDNA Cytb序列已上傳至NCBI數據庫，登錄號為MH141624～ MH141793。經過同源比對后，用于下游分析的基因片段全長1039 bp，共檢測到69個突變位點，突變率6.6%，包含簡約信息位點(Parsimony-informative sites) 31個，單突變位點(Singleton sites)38個。序列中A、T、G和C的平均含量分別為27.8%、27.3%、14.8%和30.1%，遵循A+T＞G+C的規律。編碼序列出現了明顯的反G偏倚(Anti-G bias)現象，尤其體現在第3位密碼子G的含量(7%)上。Saccone等(1999)認為這種偏倚現象與線粒體基因組的進化趨勢相關，物種由低等向高等進化過程中，反G偏倚會逐漸弱化，在鳥類和哺乳類動物線粒體中G的含量達到最高。

溫州光唇魚6個群體共170條序列定義了28個單倍型，其中，群體間共享單倍型9個，包含148個個體，占總樣本數的87.06%；特有單倍型19個，包含22個個體，占總樣本數的12.94%。

各群體的單倍型多樣性為0.308～0.876，核苷酸多樣性為0.00112～0.00838。其中，BC群體定義13條單倍型，單倍型多樣性最高；NT群體檢測到38個多態位點，核苷酸多樣性最高(表2)。

表2 溫州光唇魚6個群體遺傳多樣性參數 Tab.2 Population genetic diversity of 6 populations of A.wenchowensis

2.2 群體遺傳結構分析

單倍型系統發生分析選擇光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)(登錄號：KF781289)作為外群，構建進化樹。如圖2所示，28個單倍型形成了4個支系，其中 HAP1、4、5、11、12、13、17、18、21、22聚為支系一，HAP6、7、9、15、16、19、20、27聚為支系二，HAP2、8、10、14、23、24、25、26、28聚為支系三，HAP3聚為支系四。

圖2 基于貝葉斯法構建的28個單倍型系統進化樹 Fig.2 Phylogenetic tree for 28 haplotypes constructed based on BI method

采用中介網絡理論(Median joining,MJ)繪制的單倍型網絡圖中，28個單倍型也形成了4個支系。不同支系內出現了多個主體單倍型(支系一為HAP1，支系二為HAP7，支系三為HAP2)，其他單倍型呈輻射狀環繞在主體單倍型周圍(圖3)。

將溫州光唇魚6個不同地理種群設定為同一組群，執行AMOVA分析(表3)，估算種群間和種群內個體間變異率。結果表明，新安江溫州光唇魚整體的變異主要來自于群體內，變異比例為66.85%，而種群間的變異僅占33.15%。

圖3 基于中介網絡理論構建的單倍型中介網絡圖 Fig.3 Haplotypes network based on MJ method

表3 溫州光唇魚6個群體分子變異分析 Tab.3 AMOVA of 6 populations of A.wenchowensis

不同群體間的Fst值見表4，溫州6個地理群體出現了不同程度的分化，其中，SF和ZJK兩個群體之間的分化程度最高(Fst=0.73281)，而BC和NT群體間未檢測到明顯分化(Fst=0.02389)。少數群體間存在著不同水平的基因流(Nm＞1)，6個群體間的平均基因流Nm=2.04。

表4 群體間遺傳分化指數(Fst)和群體間有效 遷徙個體數(Nm) Tab.4 Pairwise values of Fst (below diagonal) and Nm(above diagonal) between populations

2.3 群體歷史動態

6個群體的中性檢驗顯示Tajima'sD和Fu'sFs為負值，其中Fu'sFs結果顯著(表5)?；谄谕党掷m增長模式下的錯配分布分析結果顯示，曲線呈現單峰泊松分布，且實際觀測結果與期望的假定模型吻合度較高(圖4)。因此，認為新安江溫州光唇魚群體可能經過擴張或者仍處于持續增長狀態。

表5 溫州光唇魚群體中性檢驗和錯配分布參數 Tab.5 Neutral test and mismatch distribution of nucleotide of A.wenchowensis populations

圖4 溫州光唇魚堿基錯配分布 Fig.4 Nucleotide mismatch distribution of A.wenchowensis

選擇GTR+Gamma替代模型，基于寬松分子鐘(Relaxed clock)理論構建了貝葉斯天際線圖來模擬群體變化動態。BSP結果顯示(圖5)，新安江溫州光唇魚6個群體發生過擴張事件。由于未見溫州光唇魚mtDNA Cytb基因分子進化速率的報道，研究基于Gamma替代模型并輔以選擇壓估算校正，估算了溫州光唇魚mtDNA Cytb基因位點進化速率u為2.87～3.00/百萬年?？紤]到光唇魚屬于2齡性成熟魚類，將表5中的τ值代入公式τ=2ut，推算出新安江溫州光唇魚群體擴張時間約為335萬年前。

為了追溯該流域光唇魚群體的擴張歷史，重建其祖先群體的分布情況，本研究基于貝葉斯二進制法(Bayesian binary method,BBM)和分散-隔絕理論(Statistical dispersal-vicariance method,S-DIVA)，重新構建了溫州光唇魚祖先群體分布地(圖6)。圖中上半區是新安江的地圖，按照采集到的群體分布，將該區域劃分成A～F六片區域，分別為A率水上游、B率水下游、C昌溪、D休寧河、E練江、F錦溪。下半區則是基于Fst值構建的鄰接樹(Neighbor joining)拓撲學結構，進行的祖先起源地重建以及隨后的物種區 域進化推測結果。結果顯示，新安江水系溫州光唇魚可能起源于率水上游和練江上游，隨后群體逐漸擴張，形成現在的分布。

圖5 溫州光唇魚群體歷史動態 Fig.5 Historical demography of A.wenchowensis

圖6 基于BBM和S-DIVA理論重建的祖先起源地 Fig.6 The ancestral area reconstruction inferred from BBM and S-DIVA

3 討論

3.1 新安江流域溫州光唇魚群體遺傳多樣性

遺傳多樣性是種群適應外界環境、延續物種生存的遺傳基礎，與種群的擴張、遷徙、選擇和分化息息相關(Crawfordet al,2010; Lacy,1987)。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是評價種群遺傳多樣性的重要指標，其數值的大小可直觀地反映遺傳多樣性的高低。

新安江流域溫州光唇魚6個地理群體的單倍型多樣性為0.799，核苷酸多樣性為0.00631，群體遺傳多樣性水平較低，這與胡玉婷等(2017)對皖南山區光唇魚的研究結果相一致。新安江水系較為封閉，與其他水系的光唇魚物種群體交流較少，加之近年來光唇魚價格越來越高，當地村民捕魚熱情高漲，溫州光唇魚野生群體數量較少，多種原因造成了該水系溫州光唇魚群體遺傳多樣性較低的現象。建議該水域的溫州光唇魚資源應以保護為主，科學劃定休漁期和禁捕區，對資源量豐富、遺傳多樣性相對高的群體(BC、NT)可適度開發。

3.2 溫州光唇魚群體遺傳分化

新安江流域河流呈現出支流多、蜿蜒盤曲、河道窄、河水淺、河床地質為巖石、水質清澈、河道比降大等特點(王文劍,2014)。采樣過程中，發現光唇魚分布豐度由一級支流至二級、三級支流呈現顯著的增長趨勢，這與Zhu等(2017)的研究結果相印證。復雜的水系加之季節性的干旱斷流和人為建壩的影響，導致了溫州光唇魚出現了棲息地斑塊化(Habitat Patch)現象(Er?set al,2005)，不同地理群體間很少有基因交流的機會。因此，在長期遺傳漂變的作用下，各個群體分別出現了不同程度的遺傳分化。BC群體采集于多條支流交匯后的水域，個體可能來自上游多個群體，因此，未檢測到地理分化，群體個體分布于4個進化支系中。

然而，AMOVA分析結果顯示，6個地理群體的主要遺傳變異仍來自于群體內部，群體間的遺傳變異占33.15%。結合估算的群體擴張時間為335萬年前，認為新安江溫州光唇魚群體擴張-隔絕-分化事件所處地質年代較新(上新世晚期)，群體間隔絕時間較短，較之遺傳漂變，基因流在形成群體遺傳結構中占主導作用(平均基因流Nm=2.04)。因此，雖然6個群體檢測到一定的地理分化，但大多數的分子遺傳變異仍來自于群體內個體間。

3.3 新安江溫州光唇魚群體擴張歷史

研究表明，多數物種，如魚類、爬行類，在冰川時期都經歷過種群收縮(Zhouet al,2015; 周偉等,2017)。由于地表溫度過低，物種僅能存活在冰期避難所中，以免滅絕。而處于避難所中的物種，由于溫度適宜、資源豐富，往往比冰期后擴張的物種有著更長的群體進化歷史。對新安江溫州光唇魚群體歷史動態分析暗示，溫州光唇魚于335萬年前(上新世晚期)發生過群體擴張事件，此時全球處于末次冰川時期的早期(Zachoset al,2001)。地表溫度驟降并未影響到新安江溫州光唇魚群體的擴張。因此，推測新安江流域可能是潛在的冰期避難所。

原種保護一直是保育生物學的重點工作，檢測到不同地理群體間的遺傳分化，引起了作者對該流域溫州光唇魚原種群鑒定的興趣。結合溫州光唇魚現有的分布和祖籍地重建分析結果，推測新安江流域溫州光唇魚起源于ZJK和SF兩個種群，即原種群，經過一系列的種群擴散-隔絕-分化事件，形成現今的分布。研究通過廣泛采樣，采用嚴格母系遺傳的mtDNA Cytb基因序列作為分子標記，追溯該物種的起源，鑒定新安江流域溫州光唇魚的原種群，為該物種種群保護的優先級提供理論依據。