玫瑰茄花色苷的降解動力學及抗氧化性

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(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

花色苷廣泛存在于植物的花、果實、種子和葉片中,賦予了植物萬紫千紅的顏色變化。食品中常見的花色苷主要包括6種(天竺葵色素、芍藥色素、矢車菊色素、飛燕草色素、錦葵色素和牽牛色素)[1-2]?；ㄉ找装l生降解,其穩定性除了受本身結構的影響外,還與外界因素如溫度、pH、光照、抗壞血酸、氧氣和金屬離子等有關[3]?；ㄉ战到獾耐緩娇赡苡袃煞N,一是花色苷的C3糖苷鍵先發生水解,然后其苷元發生水合反應生成花色苷假堿形式,再異構化生成查耳酮及其同分異構體α-二酮;二是花色苷先通過生成假堿葡萄糖苷,然后開環生成查耳酮糖苷,再脫去糖苷生成查耳酮及α-二酮,最后徹底降解成為醛類和酚酸[4-5]。此外,在不同的pH下,花色苷也會發生結構上的轉換。在pH<2時,花色苷主要以紅色的花色烊陽離子形式存在,當pH為3～6時主要以無色的甲醇假堿和查爾酮假堿的形式存在,而在中性偏堿時,則主要以紫藍色的醌式堿形式存在[4,6]。隨著對花色苷降解機制研究的深入,蛋白質、羧甲基纖維素(Carboxymethylcellulose,CMC)、海藻酸鈉和β-環糊精等穩定劑不斷被運用到食品藥品工業中,為改善花色苷的穩定性提供了新的方法[7]。

玫瑰茄(HibiscussabdariffaL.)原產于西非和印度,是錦葵科本槿屬一年生直立草本植物,主要分布于我國廣東、福建和臺灣等地區。玫瑰茄花萼中含有豐富的花色苷,是制備花色苷的重要原料。據報道,玫瑰茄色素的主要成分是飛燕草素-3-接骨木二糖苷、矢車菊素-3-接骨木二糖苷、飛燕草素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷[8-9]。玫瑰茄花色苷不僅顏色艷麗、無毒副作用,而且具有降血壓[10-11]、降血脂[12-13]和抗氧化[14]等功效,因此具有很高的藥用價值。

熱處理在食品加工中是一種非常普遍和有效的保存飲料的手段,在熱加工的過程中可能會導致花色苷發生降解[15]。海藻酸鈉和CMC具有良好的食用安全性及生物相容性,是食品工業中應用極其廣泛的穩定劑。這些穩定劑能有效地減緩光、熱等外界不利因素對花色苷的破壞。本試驗對不同pH、溫度和添加穩定劑條件下玫瑰茄花色苷熱穩定性和抗氧化性進行研究,建立其熱降解動力學模型并探究熱加工過程中花色苷清除DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基和ABTS(2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)自由基能力的變化,為有效控制玫瑰茄花色苷在加熱過程中的降解提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玫瑰茄 采自于湖南高產奇和醫藥合富農業有限公司,冷凍干燥后備用;AB-8型大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司;DPPH、ABTS、乙酸鈉、氯化鉀、無水乙醇、鹽酸和氫氧化鈉等 分析純,廣州化學試劑批發公司;海藻酸鈉、CMC 化學純,廣州卯林儀器有限公司。

DFY-500型中藥粉碎機 上海新諾儀器設備有限公司;7110型酸度計 德國WTW;分析天平 歐洲RADWAG;2L-AREI旋轉蒸發器 上海皓莊儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;SpectraMax i3x多功能酶標儀 Molecular Devices;層析柱(1.8 cm×30 cm) 上海亞榮生化儀器廠;6000LDI恒流泵 美國康諾(CoMetro);SCIENTZ-10N型真空冷凍干燥機 北京松源華興生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰茄花色苷凍干粉制備 根據預實驗,將玫瑰茄粉碎后過20目篩,按料液比1∶30加入60%乙醇并用磁力攪拌子以200 r/min的速率攪拌30 min,再置于4 ℃冰箱過夜(12 h)。真空抽濾后,用60%乙醇沖洗濾渣至發白,合并兩次濾液。40 ℃下旋轉蒸發至無乙醇,得到玫瑰茄花色苷濃縮液,冷凍干燥后得到花色苷粗提物。采用AB-8大孔樹脂純化玫瑰茄花色苷,上樣濃度和體積分別為600 mg/L和183 mL,進樣完全后平衡3 h,再用5倍柱體積的蒸餾水沖洗樹脂,后用60%的乙醇洗脫花色苷并收集洗脫液,洗脫流速為1 mL/min。經凍干后得到暗紅色的玫瑰茄花色苷純化物,-20 ℃貯存備用。實驗前用蒸餾水將其復溶為玫瑰茄花色苷溶液。

1.2.1.1 花色苷濃度測定 色素濃度的測定采用pH示差法[19],含量由等量矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cyd-3-G)表示,計算公式如下:

C=(A×MW×DF×1000)/(ε×1)

式(1)

式中:C為花色苷濃度(mg/L);A為pH1.0時花色苷在520 nm與700 nm的吸光值之差減去pH4.5時花色苷在520 nm與700 nm的吸光值之差;MW為Cyd-3-G的分子量449.2 g/mol;DF為稀釋倍數;1000為將單位由g轉化為mg的倍數;ε為摩爾消光系數26900 L/(mol·cm);1為比色皿寬度(cm)。

1.2.1.2 色價測定 參考文獻[8]并稍作修改,具體為:稱取花色苷純化物0.1 g,用pH1.0氯化鉀緩沖液稀釋至100 mL,再吸取10 mL,用氯化鉀緩沖液稀釋至100 mL,在最大吸收波長處測定其吸光值,計算公式為:

色價=A×r/W

式中:A為吸光度；W為樣品的質量(g)；r為測定吸光度時所吸取樣品的稀釋倍數。

1.2.1.3 花色苷回收率測定 參考文獻[8],花色苷回收率的計算公式如下:

回收率(%)=實際回收花色苷質量/理論回收花色苷質量

1.2.2 pH和溫度對花色苷穩定性的影響 參考文獻[16]并稍作修改,具體為:稱取一定量純化后的玫瑰茄花色苷凍干粉,用0.2 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制母液并用氫氧化鈉和鹽酸調節pH,最終配制成pH分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0的花色苷溶液(花色苷含量為216.50 mg/L),分裝于5個具塞試管中,每個試管中的花色苷溶液體積均為20 mL,分別在80、90、100 ℃下避光加熱150 min,每隔30 min測定5組花色苷含量的變化,每個實驗重復3次,取平均值。其中為避免溶液在加熱過程中水分蒸發而引起濃度變化,每次取樣后,標記好水位線,下次取樣測量前用相同溫度的蒸餾水將花色苷溶液補充至前一次取樣后的水位線。

1.2.3 穩定劑對花色苷的影響 分別在燒杯中加入花色苷凍干粉末、CMC或海藻酸鈉(穩定劑),加少量蒸餾水并在室溫下磁力攪拌20 min,繼續加水至固體完全溶解并轉移至250 mL容量瓶中進行定容,分別配成0.5%、1.0%和1.5%穩定劑的花色苷膠體溶液(花色苷含量為216.50 mg/L)。各取20 mL于具塞比色管中,分別在80、90和100 ℃下加熱150 min。

1.2.4 玫瑰茄花色苷抗氧化性測定

1.2.4.1 DPPH抗氧化能力 根據參考文獻[17],具體操作如下:花色苷溶液或Trolox(100 μL)加入到100 μL DPPH(6×10-5mol/L)儲備液中,在室溫下避光反應30 min。反應結束后,使用酶標儀在517 nm處測量混合物的吸光度值。自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100，A1為樣品溶液吸光度值，A0為空白溶液吸光度值。根據標準曲線計算DPPH自由基清除能力。結果表示為Trolox當量(Trolox equivalent，TE)mg Trolox/mL樣品。對照指的是對應pH條件下初始的、未經過加熱時溶液的DPPH抗氧化能力。

1.2.4.2 ABTS抗氧化能力 根據參考文獻[18],具體操作如下:將7 mmol/L的ABTS+·溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀水溶液混合,制為ABTS+·母液,低溫避光保存過夜(12～16 h),使用前用無水乙醇稀釋直至在734 nm下吸光度值為0.7±0.02,得到ABTS+·工作液(現用現配)。

花色苷溶液或Trolox(100 μL)加入到100 μL ABTS+·(6×10-5mol/L)工作液中,在室溫下避光反應6 min。反應結束后,使用酶標儀在734 nm處測量混合物的吸光度值。自由基清除率(%)=(A0-A1)/A0×100，A1為樣品溶液吸光度值，A0為空白溶液吸光度值。根據標準曲線計算ABTS自由基清除能力。結果表示為Trolox當量(Trolox equivalent，TE)mg Trolox/mL樣品。對照指的是對應pH條件下初始的、未經過加熱時溶液的ABTS抗氧化能力。

1.2.5 降解動力學參數測定 應用一級動力學模擬不同條件下花色苷的降解[20]。動力學公式如下:

一級動力學方程:ln(Ct/C0)=-kt

式(2)

其中：C0為花色苷的初始濃度(mg/mL),t為加熱時間(h),Ct為t時刻花色苷的濃度(mg/mL),k為速率常數。

玫瑰茄花色苷半衰期 t1/2(h)計算公式如下:

t1/2=ln0.5/k

式(3)

其中k為速率常數。

利用Arrhenius方程計算活化能如下:

lnk=lnK0-(Ea/RT)

式(4)

其中:Ea是活化能(kJ/mol),R為氣體常數8.314 J/mol·K,T為絕對溫度(K),K0是頻率因子。

花色苷的溫度系數Q10計算如下:

Q10=(k1/k2)10/(T1-T2)

式(5)

其中:T為溫度(℃),k為T ℃下的降解速率。

1.3 數據處理

2 結果與討論

2.1 純化效果分析

如表1所示,純化后的玫瑰茄花色苷為紅色粉末,其色價為43.10±2.17,回收率為83.62%±5.72%,用pH示差法測得凍干粉花色苷含量為(216.50±1.83) mg/g。

表1 花色苷純化前后品質對比Table 1 Comparison of the quality of anthocyanins before and after purification

2.2 溫度對花色苷穩定性的影響

在80～100 ℃溫度和不同pH條件下花色苷的降解實驗結果見圖1。不同pH下花色苷的降解動力學參數見表2。由圖1可知,玫瑰茄花色苷在80、90和100 ℃三個溫度條件下的降解均符合一級動力學方程,其降解屬于裂解反應,即花色苷被裂解為糖基和花色素基元兩部分[21]。這與報道文獻中黑米[21]、藍莓[22]花色苷熱降解動力學過程研究結果相吻合?；ㄉ諢峤到鈾C制為:花色苷首先發生水解或去糖基開環反應,然后形成查耳酮或其同分異構體α-二酮,最后降解為酚酸和醛類[5]。

表2 不同pH和溫度下花色苷的降解動力學參數Table 2 Degradation kinetics of anthocyanins at different pH values

圖1 不同pH和溫度下花色苷降解動力學Fig.1 Degradation kinetics of anthocyanins under different pH values and temperatures

從圖1和表2可知,在所有的pH條件下,玫瑰茄花色苷的降解速率常數均隨著溫度的升高而增大,半衰期隨著溫度的升高而減小。從表2可知,在pH2.0、80 ℃和pH5.0、100 ℃時,花色苷分別有最低的降解速率常數(0.2539 h-1)和最高的降解速率常數(0.6547 h-1)?；ㄉ盏臏囟认禂礠10表示溫度每升高10 ℃反應速率增大的比例,Q10越大說明溫度對降解的影響也越大。pH大于1.0時,在相同pH條件和80～90 ℃條件下,Q10均比90～100 ℃條件下的Q10要小,表明隨著溫度的升高,玫瑰茄花色苷降解速率增加。在pH1.0時,80～100 ℃條件下花色苷降解速率相同。

2.3 pH對花色苷穩定性的影響

如表2所示,玫瑰茄花色苷降解速率常數隨著pH的增加而增加,花色苷的半衰期則呈現減少的趨勢。這是由于花色苷可隨溶液pH變化而發生結構上的轉化。當pH<2時,花色苷主要以紅色的2-苯基苯并吡喃陽離子形式存在;pH為3～6時,以無色的甲醇假堿或查爾酮形式存在;pH>8 時,以藍色的離子化醌式堿形式存在[4,6,23]。在酸性水溶液中,花色苷同時存在酸堿平衡、水和平衡和環-鏈異構化三種化學平衡。一般而言,在相同的外界條件下,pH越大,花色苷的降解速度越快[6,24]。在本試驗中,隨著pH增加,花色苷的Q10均逐漸增大(pH2.0例外),表明溫度對花色苷的影響隨著pH的增加而增加。同時由表2可知,pH1.0和pH2.0 的Q10明顯小于pH3.0、pH4.0和pH5.0(pH3.0,80～90 ℃條件下的Q10除外)。這表明pH1.0和pH2.0時溫度對花色苷的降解速率影響小于其他pH對其降解的影響。這與文獻[25]對桑葚花色苷降解的研究結果相吻合。隨著pH從1.0上升到5.0的過程中,玫瑰茄花色苷的Ea逐漸降低,同時pH<3時玫瑰茄花色苷降解速率常數要比pH≥3時要低,表明花色苷在pH<3時穩定,在pH≥3時不穩定。這與前人報道一致,Wang等[26]的研究結果也表明低pH時更有利于藍莓花色苷的穩定。在不同的pH和溫度組合下,花色苷在穩定性方面表現出不同的結果(表2)。pH和溫度的綜合影響既不是簡單的個別效應的累加,也不是它們的線性組合。pH在熱處理下穩定花色苷中起著重要的作用。較低的pH有助于降低花色苷的熱損傷,特別是在高溫處理過程中。然而與pH相比,溫度對兩種花色苷的穩定性影響較大，由溫度升高引起的花色苷的損失比由pH增加引起的損失更大。如在80 ℃條件下,當pH從1.0上升到5.0，玫瑰茄花色苷的解速率常數由0.2570 h-1逐漸增加到0.3765 h-1。而在100 ℃條件下,隨著pH從1.0增加到5.0,玫瑰茄花色苷的解速率常數由0.3213 h-1逐漸增加到0.6547 h-1。試驗結果表明,溫度對花色苷的穩定性的影響大于pH。因此,在食品熱加工過程中,應首先考慮將熱損失降到最低,然后降低食品的pH。

2.4 穩定劑對花色苷穩定性的影響

圖2～圖4分別是添加0.5%、1.0%和1.5%穩定劑對花色苷在不同溫度下降解的影響,表3為添加海藻酸鈉/羧甲基纖維素條件下花色苷的降解動力學參數。從表3可知,在添加了CMC的樣品中,花色苷最高的降解速率常數(0.3699 h-1)和最低的降解速率常數(0.0944 h-1)分別在100 ℃和80 ℃時出現,此時CMC的添加量也分別為最低濃度的0.5%和最高濃度的1.5%,說明CMC能提高花色苷溶液的熱穩定性。這是由于CMC屬于水溶性高分子,在水溶液中CMC分子互相纏繞,其長鏈分子及數量龐大的支鏈分子形成無規則線團狀態。當與水溶液中其他小分子相遇時能迅速在其表面形成一層致密的包裹層。同時,CMC分子結構產生的空間位阻作用和靜電排斥作用使其分子間不能靠近,從而提高了溶液的穩定性[27-28]。李煒[29]發現,在水溶液中添加CMC能有效減輕梔子黃色素的氧化降解反應,CMC分子可在梔子黃色素分子表面形成包裹層,梔子黃色素分子所處的微觀環境被改變,氧化離子對梔子黃色素分子的碰撞也大大減少。同樣地,海藻酸鈉也能提高花色苷溶液的熱穩定性。在添加了海藻酸鈉的樣品中,花色苷的最高的降解速率常數(0.3447 h-1)和最低的降解速率常數(0.0988 h-1)分別在100 ℃和80 ℃時出現,此時海藻酸鈉的添加量分別為0.5%和1.5%。因為海藻酸鈉屬于聚糖醛酸鹽,其羧基可與花色苷黃嘌呤陽離子通過靜電作用發生締合,從而提高花色苷的穩定性[30]。在添加同一濃度穩定劑條件下,花色苷的降解速率常數均隨著溫度的增大而增大。當溫度為80～90 ℃時,添加穩定劑組的Q10比空白組大,表明在此溫度區間,溫度對添加穩定劑組花色苷降解的影響要大于空白組。而當溫度為90～100 ℃時,空白組的Q10均比添加穩定劑組大,表明在此溫度區間,溫度對空白組花色苷降解的影響要大于添加穩定劑組。

表3 添加穩定劑條件下花色苷的降解動力學參數Table 3 Degradation kinetic parameters of anthocyanins added with stabilizers

圖2 穩定劑對花色苷在80 ℃時降解的影響Fig.2 Effect of stabilizers on the degradation of anthocyanins at 80 ℃

圖3 穩定劑對花色苷在90 ℃時降解的影響Fig.3 Effect of stabilizers on the degradation of anthocyanins at 90 ℃

圖4 穩定劑對花色苷在100 ℃時降解的影響Fig.4 Effect of stabilizers on the degradation of anthocyanins at 100 ℃

2.5 抗氧化性研究

2.5.1 pH和溫度對花色苷溶液抗氧化性的影響 表4和表5分別代表了80、90和100 ℃下花色苷溶液的DPPH和ABTS抗氧化能力。從表4和表5可知,對照花色苷DPPH抗氧化能力為0.453～0.721 mg Trolox/mL,其ABTS抗氧化能力為0.786～0.973 mg Trolox/mL。

表4 不同溫度下花色苷溶液的DPPH抗氧化能力(mg Trolox/mL)Table 4 DPPH antioxidant activity of anthocyanin solutions at different temperatures(mg Trolox/mL)

表5 不同溫度下花色苷溶液的ABTS抗氧化能力(mg Trolox/mL)Table 5 ABTS antioxidant activity of anthocyanin solutions at different temperatures(mg Trolox/mL)

雖然玫瑰茄花色苷的抗氧化能力在熱處理前1.5 h不斷波動,但是經過熱處理2.5 h后,其體外抗氧化能力相比于對照組樣品顯著下降(p<0.05)。對于前期抗氧化性的波動起伏,本實驗有以下解釋?；ㄉ盏囊恍┙到猱a物,如原兒茶酸(procatechuic acid)、2,4,6-三羥基苯甲醛(phloroglucinaldehyde)和4-羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid),可能對維持熱處理過程中花色苷的抗氧化能力起到很大的作用[32]。類似研究表明,從紫色馬鈴薯提取的花色苷在經過100～150 ℃熱處理1 h后,其抗氧化能力也沒有表現出顯著的下降趨勢[33]。即在加熱的前期過程中,花色苷抗氧化能力的波動有可能是由于其降解產物對其總體抗氧化能力的影響所致。經過熱處理2.5 h后,隨著花色苷的降解以及溫度對降解物一定程度的破壞,花色苷體系的整體抗氧化能力有所下降,因此花色苷的加工過程中要避免長時間的熱處理。

pH對玫瑰茄花色苷溶液的抗氧化能力有很強的影響。在本實驗中,隨著pH的升高,花色苷抗氧化能力呈下降趨勢。pH1.0和pH2.0條件下的花色苷溶液具有最高的抗氧化能力,其DPPH和ABTS抗氧化能力分別為(0.703±0.013)、(0.973±0.102) mg Trolox/mL和(0.721±0.034)、(0.971±0.053) mg Trolox/mL。然而在pH5.0時觀察到花色苷溶液具有較低的抗氧化能力,其DPPH和ABTS抗氧化能力分別為(0.453±0.037) mg Trolox/mL和(0.786±0.058) mg Trolox/mL。這可能是由于花色苷在不同的pH條件下具有不同的結構所致,對于玫瑰茄花色苷來說,在更低的pH條件下花色苷的形式在清除自由基方面可能更有效。

因此需要通過進一步研究將不同形式的花色苷的含量與總抗氧化能力聯系起來。然而,Sui等[16]發現隨著pH的升高,黑米花色苷溶液的抗氧化能力呈上升趨勢,而且當溶液pH=2.2時,所有溫度條件下(100、121、135、145、165 ℃)均具有最低的抗氧化能力。這可能是由于不同的花色苷的性質導致的差異。

2.5.2 穩定劑對花色苷溶液抗氧化性的影響 表6和表7分別代表了80、90和100 ℃下花色苷溶液的DPPH和ABTS抗氧化能力。從表6和表7可知,添加穩定劑能減緩高溫對玫瑰茄花色苷的總抗氧化能力的影響。添加了海藻酸鈉和CMC的溶液中,經過2.5 h的加熱后,其DPPH和ABTS抗氧化能力均比空白組高。同時,隨著穩定劑濃度的逐漸加大,花色苷溶液的抗氧化能力有增大的趨勢。同樣添加量下,海藻酸鈉對花色苷溶液抗氧化性的穩定效果較CMC好。這與Mourtzinos等[31]的研究相似,該研究表明,β-環糊精能與花色苷通過絡合而改善了玫瑰茄花色苷的熱穩定性以及更好地保留了花色苷的抗氧化性。

表6 不同溫度下添加穩定劑花色苷溶液的DPPH抗氧化能力(mg Trolox/mL)Table 6 DPPH antioxidant activity of anthocyanin solutions added with stabilizers at different temperatures(mg Trolox/mL)

續表

表7 不同溫度下添加穩定劑花色苷溶液的ABTS抗氧化能力(mg Trolox/mL)Table 7 ABTS antioxidant activity of anthocyanin solutions added with stabilizers at different temperatures(mg Trolox/mL)

3 結論

溫度和pH均影響著玫瑰茄花色苷的穩定性,且溫度對花色苷的穩定性的影響更大?？傮w而言,玫瑰茄花色苷在pH1.0和pH2.0的條件下,其熱穩定性更強。在80、90和100 ℃條件下,玫瑰茄花色苷熱降解均符合一級動力學模型,在同一pH下,其降解速率隨著溫度的升高而增大,半衰期隨著溫度的升高而減小。80、90和100 ℃下加熱2.5 h后,花色苷的抗氧化能力均出現下降。同一溫度下,在添加了穩定劑的溶液體系中,花色苷的降解速率隨著穩定劑添加量的增加而減小,海藻酸鈉和CMC能有效保護花色苷不被熱分解,相比于CMC,海藻酸鈉對花色苷的保護效果更好。以上結果提示,在食品工業生產中,為減少熱殺菌過程中玫瑰茄花色苷的降解,可采用巴氏殺菌來對玫瑰茄花色苷溶液進行滅菌處理,并盡量將其pH調控在pH3.0以內。當滅菌溫度高于80 ℃,滅菌時間應適當縮短。此外,還可考慮在花色苷溶液中添加適量海藻酸鈉來提高其熱穩定性。