枯草芽孢桿菌發酵提取物對大腸桿菌的抑制作用

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(浙江萬里學院生物與環境學院,浙江寧波 315100)

隨著人們食品安全意識的增強,傳統的化學防腐劑已不能滿足人們的需求,開發新型天然防腐劑已成為食品添加劑發展的主要方向之一。在微生物天然防腐劑中,研究最多的是乳酸鏈菌肽(Nisin)和納他霉素(Natamycin),也是目前我國允許使用的兩種天然生物保鮮劑。但是Nisin抑菌譜相對較窄,僅對革蘭氏陽性菌表現出顯著抑制作用,不能抑制革蘭氏陰性菌和真菌。Natamycin僅能有效殺滅霉菌、酵母菌和絲狀真菌,而對細菌無效。因此，研究開發安全、廣譜、高效的微生物天然防腐劑和保鮮劑具有重要意義。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)廣泛分布于自然界中,產生抗菌活性物質是其發揮生物防治功能的重要機制之一?？莶菅挎邨U菌產生的抗菌活性物質主要有兩大類:核糖體合成的抗菌蛋白和抗菌肽以及非核糖體合成的脂肽類化合物[1-3]?？莶菅挎邨U菌產生的活性代謝物質抗菌譜廣,對植物病原菌、食品腐敗菌、致病菌等有明顯的抑制作用,同時也表現出抗氧化等功能,是極具潛力的微生物天然食品防腐劑[4-5]。目前對枯草芽孢桿菌抗菌物質的研究較多,主要集中在抗菌物質分離鑒定、抑菌活性等[6-8],抑菌機制涉及較少。此外,不同枯草芽孢桿菌菌株產生的抗菌物質有較大差異,即使同一菌株,發酵條件改變也會導致抗菌物質有偏差,因此開展特定菌株的抗菌物質的篩選及活性研究,對正確利用相關菌株具有重要意義。

本文以革蘭氏陰性菌大腸桿菌為目標菌,對枯草芽孢桿菌WL17發酵抗菌物質成分及其對大腸桿菌的抑菌機理進行初步研究,以期為科學開發和利用枯草芽孢桿菌及其抑菌物質提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LB液體培養基、Hank’s溶液 北京索萊寶科技有限公司;二乙酸熒光素、鈣離子熒光探針Fluo-3/AM 美國 Sigma公司;牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-谷氨酸鈉、二甲基亞砜等 均為分析純;大腸桿菌(E.coli)ATCC25922、枯草芽孢桿菌WL17 由實驗室分離得到;種子培養基配方:牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、酵母膏5 g、葡萄糖5 g、蒸餾水1L,pH7.0～7.4;發酵培養基配方:葡萄糖20 g、MgSO40.5 g、L-谷氨酸鈉5 g、KCl 0.5 g、KH2PO41.0 g、FeSO40.15 mg、MnSO45.0 mg、CuSO40.16 mg、蒸餾水1L,pH7.2～7.4。

H-7650透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司;F-380熒光分光光度計 天津港東科技發展有限公司;754型紫外可見分光光度計 上海菁華科學儀器有限公司;LC-6AD半制備液相色譜儀 日本島津公司;LCQ Advantage電噴霧質譜儀 美國Finnigan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 枯草芽孢桿菌發酵提取物的制備 取枯草芽孢桿菌斜面菌種到種子培養基中,37 ℃、160 r/min搖床培養18 h后,按3%的接種量接入裝有100 mL發酵培養基的三角瓶中,30 ℃、160 r/min,發酵培養38 h。發酵液在4 ℃下8000 r/min離心15 min去菌體得到上清液,上清液用6 mo1/L的HCl調pH為2.5,4 ℃下沉淀1 h。然后離心(4 ℃,10000 r/min)15 min,收集沉淀物,用70%甲醇提取三次,收集提取液將其pH調為中性,旋轉蒸發后冷凍干燥得到枯草芽孢桿菌發酵提取物(BsFE)。

1.2.2 BsFE最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用液體倍比稀釋法測定BsFE對大腸桿菌的最小抑菌濃度[9]。將BsFE用LB液體培養基倍比稀釋為0.196、0.393、0.492、0.614、0.768、0.96、1.2、1.5 mg/mL濃度范圍,取對數生長期的大腸桿菌分別接種到不同BsFE濃度的LB培養基中,接種菌落數為1×105cfu/mL,同時設置空白對照組(不加BsFE,接種)和陰性對照組(不加BsFE,不接種)。各試管于37 ℃、160 r/min搖床中培養18 h后，觀測大腸桿菌的生長情況,并進行固體平板培養實驗[10],計算菌落總數,以大腸桿菌不生長的最小稀釋度對應的BsFE含量為MIC值。

1.2.3 BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響 取大腸桿菌斜面菌種到種子培養基中,37 ℃、160 r/min培養18 h作種子培養液,然后按3%的接種量分別接種于6組含有50 mL LB液體培養基的錐形瓶中,放置于37 ℃、160 r/min的搖床中進行培養。組1(空白組):接種同時添加1 mL無菌蒸餾水;組2(延滯期):接種同時添加BsFE使其濃度為1MIC;組3、組4(對數期):培養5 h后添加BsFE使其最終濃度分別為1MIC、2MIC;組5、組6(穩定期):培養10 h后添加BsFE使其最終濃度分別為1MIC、2MIC。6組分別于培養的0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24、36、48 h取樣測OD600值,制作生長曲線。

利用殺菌率考察BsFE對大腸桿菌的抑菌效果,公式如下:

殺菌率(%)=(對照OD600值-試驗組OD600值)/對照OD600值×100

1.2.4 BsFE對大腸桿菌細胞通透性的影響 取對數生長期的大腸桿菌菌液離心(8000 r/min,5 min)收集菌體,用Hank’s溶液洗滌三次,制成濃度為1×105cfu/mL的菌懸液,分別向其加入BsFE,使其最終濃度分別為0、1MIC、2MIC和3MIC。于37 ℃、160 r/min條件下,孵育2 h,離心(8000 r/min,5 min)收集菌體,菌體用Hank’s溶液洗滌三次。然后分別向菌懸液中添加二乙酸熒光素丙酮溶液和Fluo-3/AM二甲基亞砜溶液,兩者終濃度分別為0.25 mg/mL和5 μmol/L。添加二乙酸熒光素的菌懸液振蕩均勻,室溫下放置10 min后,進行熒光分析測定。添加Fluo-3/AM試劑的菌懸液振蕩均勻后,避光37 ℃下孵育30 min,5000 r/min離心5 min,菌體用Hank’s溶液洗滌三次,進行熒光分析測定。參照陳衛等[11]方法設置熒光分析測定條件:Fluo-3/AM:激發波長405 nm,掃描波長380～430 nm;二乙酸熒光素:激發波長490 nm,掃描波長460～580 nm。

相對熒光強度(%)=(添加樣品后的熒光強度/空白熒光強度)×100

1.2.5 BsFE對大腸桿菌細胞顯微特征的影響 取對數生長期的大腸桿菌種子液,接種到BsFE濃度為1MIC的LB液體培養基中,菌液濃度為1×105cfu/mL。于37 ℃、160 r/min搖床中培養3 h后,離心(8000 r/min,5 min)棄上清液,收集細胞沉淀,并用pH7.2磷酸鹽緩沖溶液洗滌三次,用2.5%戊二醛固定2 h,然后分別制備掃描電鏡和透射樣品[12-13],并進行觀察。

1.2.6 BsFE的分離純化和成分分析 采用Sephadex LH-20柱層析(1 cm×85 cm)對BsFE進行分離純化,以70%甲醇作為洗脫液,流速為0.3 mL/min,檢測波長230 nm,每6 min收集一管,按照洗脫峰合并收集液,分別濃縮后冷凍干燥得到BsFE分離組分。選取對大腸桿菌抑菌效果好的組分采用半制備液相色譜儀進行分離制備,采用Kromaisl C-18色譜柱(250 mm×10 mm,5 μm),柱溫25 ℃,以乙腈/水(0.1%三氟乙酸)為流動相,進樣量150 μL,流速4 mL/min,檢測波長230 nm,按色譜峰收集洗脫液,冷凍干燥后得到不同組分,對各組分進行抑菌分析,篩選活性大的組分,利用ESI/MS對其結構進行初步分析。ESI/MS條件如下:正離子模式,掃描范圍m/z 100～2000,毛細管電壓3.5 kV,錐電壓30 V,離子源溫度150 ℃。

1.2.7 BsFE分離組分抑菌能力的測定 參照南楠等[14]方法,將大腸桿菌培養至對數生長期,調整其菌體濃度為1×105cfu/mL,采用牛津杯雙層平板法測定BsFE分離組分的活性。普通營養瓊脂培養基15 mL為下層培養基,凝固后加入混有菌液的改良營養瓊脂培養基(瓊脂含量為8%)5 mL,即上層培養基。在雙層平板上放置牛津杯,分別添加0.2 mL經0.45 μm濾膜過濾的相同濃度的不同組分溶液于牛津杯中,37 ℃培養18～20 h,測定抑菌圈的大小,每個實驗重復三次。

1.3 數據處理

實驗均重復三次,采用Excel 2010進行統計分析,實驗數據用實驗結果的平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 BsFE最小抑菌濃度(MIC)的測定結果

由實驗結果可知,當濃度大于0.614 mg/mL時,接種培養后菌體不變渾濁,BsFE濃度越小,培養液越渾濁,這是因為濃度小于0.614 mg/mL時BsFE無法有效抑制菌體的繁殖生長。取0.614 mg/mL附近的濃度進行平板培養,結果如表1所示,當BsFE濃度小于0.614 mg/mL時,可以觀察到菌落生長,而大于0.614 mg/mL時,無菌落生長,因此BsFE的最小抑菌濃度為0.614 mg/mL。

表1 固體平板法驗證BsFE的最低抑菌濃度Table 1 Validation the MIC of BsFE by solid plate method

2.2 BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響

分別在大腸桿菌生長的延滯期、對數期和穩定期添加不同濃度的BsFE,結果如圖1所示。組2于延滯期加入1MIC的BsFE(0 h、1MIC),生長曲線一直保持在較低水平,表明BsFE能夠有效地抑制大腸桿菌的生長,并表現出一定的溶菌作用。組3和組4分別在對數生長期加入不同濃度的BsFE(5 h、1MIC,5 h、2MIC),其對大腸桿菌的抑菌和溶菌作用明顯,能在短時間內降低其菌體濃度,但添加量對抑菌作用無明顯影響。組5和組6分別在穩定期加入不同濃度的BsFE(10 h、1MIC,10 h、2MIC),高濃度(2MIC)下其抑菌和溶菌作用明顯好于低濃度(1MIC)。

圖1 BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響Fig.1 Effects of BsFE on E.coli growth curve

2.3 BsFE對大腸桿菌細胞通透性的影響

經BsFE作用的大腸桿菌細胞染色后的熒光強度變化如圖2所示,染色后的細胞在512 nm處熒光強度最大,熒光強度隨BsFE濃度的增大而降低,添加1MIC、2MIC、3MICBsFE的相對熒光強度分別為85.3%、75.5%和47.9%。二乙酸熒光素本身不發熒光,但它能夠穿透細胞膜被細胞內的非特異性酯酶水解為熒光素[15-16],當細胞膜受到破壞,膜通透性變大,會導致熒光從胞漿中外漏致使熒光強度下降。因此,實驗結果表明BsFE能夠破壞大腸桿菌細胞膜的完整性,且濃度越高,破壞程度越大。

圖2 BsFE對大腸桿菌細胞FDA染色后熒光強度的影響Fig.2 Effect of BsFE on the fluorescence intensity of the E. coli by FDA staining

細胞膜通透性的變化可導致細胞內鈣離子濃度的改變,采用Fluo-3/AM熒光探針檢測BsFE處理后大腸桿菌細胞鈣離子濃度的變化,可反映其細胞膜通透性的變化。對BsFE處理后的大腸桿菌細胞進行Fluo-3/AM負載,孵育后熒光強度變化如圖3所示,408 nm處熒光強度最大。隨著BsFE濃度的增大,熒光強度不斷增加,經1MIC、2MIC和MIC BsFE處理后,相對熒光強度分別達202%、245%和318%。結果表明經BsFE處理后,細胞內鈣離子濃度大幅度增加,即BsFE處理能破壞大腸桿菌細胞膜的完整性,這與圖2所得結果相一致。

圖3 BsFE對大腸桿菌細胞內Ca2+濃度的影響Fig.3 Effect of BsFE on the calcium concentration in the E. coli cell

2.4 BsFE對大腸桿菌細胞顯微特征的影響

采用掃描電鏡和透射電鏡觀察BsFE對大腸桿菌細胞形態結構的影響,推斷BsFE作用導致大腸桿菌細胞破裂的情況,結果如圖4～圖5所示。

圖4 掃描電鏡觀察BsFE對大腸桿菌細胞形態結構的影響Fig.4 Effect of BsFE on the structure ofE. coli under scanning electron microscope注:A:空白組;B:BsFE處理組。

圖5 透射電鏡下BsFE對大腸桿菌細胞形態結構的影響Fig.5 Effect of BsFE on the structure ofE. coli under transmission electron microscope注:A:空白組0.5 μm;B:BsFE處理組0.5 μm; C:BsFE處理組0.2 μm。

掃描電鏡下空白組菌體細胞飽滿,細胞輪廓清晰,表面完整光滑,呈現兩端鈍圓的短桿狀,而BsFE作用3 h后,菌體細胞粗糙,大量菌體表面出現褶皺及凹陷,異常菌體數量增多,表明BsFE能有效地破壞細胞表面結構,造成細胞結構形態的改變。透射電鏡下空白組菌體細胞完整光滑,細胞膜與細胞壁結合緊密,細胞質均勻,細胞整體無缺陷、無斷裂,而BsFE作用3 h后,菌體細胞邊緣模糊,細胞壁缺失,細胞膜破裂,細胞質大量流失,表明BsFE能導致細胞膜的破裂,內容物泄露,最終致使細胞死亡。

2.5 BsFE的分離純化和成分分析

BsFE采用Sephadex LH-20柱層析(1 cm×85 cm)分離可得3個主要組分(S1、S2、S3),選取抑菌活性最強的組分(S3)采用半制備液相色譜進行分離制備,可得6個主要組分(圖6),其中峰Ⅰ、峰Ⅴ和峰Ⅵ對大腸桿菌有抑制作用(表2),故對這三個組分進行了ESI/MS分析(表3),結果提示BsFE中主要抑菌成分可能是多烯類化合物和脂肽類化合物。1L發酵液可以獲得組分Ⅰ10.25 mg,組分Ⅴ77.48 mg,組分Ⅵ5.73 mg。

表2 分離組分Ⅰ～Ⅵ抑菌活性的分析Table 2 Antimicrobial activities of componentsⅠ～Ⅵ

圖6 S3的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of S3

表3 分離組分Ⅰ、Ⅴ和Ⅵ的質譜分析Table 3 ESI/MS analysis of componentsⅠ,Ⅴ and Ⅵ

3 討論

枯草芽孢桿菌發酵提取物BsFE對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)為0.614 mg/mL。有研究報道陽離子抗菌肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌以及真菌的最低抑菌濃度范圍為0.25～16 μg/mL[17]。黃現青[4]研究發現BacillussubtilisfmbJ產生的脂肽對大腸桿菌的最低抑菌濃度為468.75 μg/mL。相比較,BsFE的MIC值較高,可能是因為抗菌物質不同,同時與試驗所用BsFE為混合物有關?？咕镔|的抑菌作用主要有抑菌不溶菌和抑菌并溶菌兩種,前者菌體的生長曲線保持一定的濁度水平,不升高也不下降,后者菌體生長曲線會下降[18]。BsFE對大腸桿菌生長曲線的影響表明BsFE能夠有效地抑制大腸桿菌的生長,并表現出一定的溶菌作用,且在延滯期和對數期加入BsFE后溶菌作用更明顯。另外,考察BsFE對大腸桿菌的殺菌率發現,在延緩期和對數生長期加入BsFE后殺菌率分別能達到80%和60%以上,而在穩定期對大腸桿菌的殺菌率較低,僅為40%左右,說明BsFE對低濃度菌體具有更好的殺菌效果。

盧群等[19]在研究中證實二乙酸熒光素能夠有效的載入活的大腸桿菌細胞,可以通過熒光強度的變化表征細胞膜的完整性。Fluo-3/AM在進入細胞后經非特異性酯酶脫去AM酯,與細胞內游離鈣離子結合后，熒光強度增加，且與鈣離子濃度成比例關系[20],細胞膜通透性的變化可導致細胞內液中鈣離子濃度的改變,因此采用Fluo-3/AM熒光探針檢測可反映細胞膜通透性的變化。二乙酸熒光素染色法和Fluo-3/AM熒光探針法的試驗結果均表明，BsFE能夠增加大腸桿菌細胞膜的通透性,使得大量的熒光素隨細胞內容物泄露出來，且Fluo-3/AM能夠更容易進入細胞內部。為進一步說明BsFE對大腸桿菌菌體細胞的影響,采用掃描電鏡和透射電鏡觀察BsFE對大腸桿菌細胞形態結構的影響,從而推斷BsFE處理能夠導致大腸桿菌細胞的破裂。由此說明，BsFE能夠通過改變細胞膜的結構形態來影響菌體細胞的新陳代謝,從而抑制其生長繁殖。BsFE的抗菌作用可能是通過膜結合性實現的,膜結合性抗菌是一種比較被認可的抗菌作用模型[21-22],該模型認為抗菌物質的膜結合性使其穿透細胞壁結合到細胞膜表面,通過改變膜的通透性或在膜上形成離子通道或進入細胞內部，抑制DNA、RNA和蛋白質的合成，致使細胞死亡。BsFE分離純化后對具有大腸桿菌抑制作用的組分進行初步成分分析,與相關文獻比對[23-27],推測BsFE抑菌活性成分包含多烯類化合物和脂肽類化合物,具體的分子結構有待進一步確定。

4 結論

研究結果表明,枯草芽孢桿菌發酵提取物(BsFE)對大腸桿菌具有明顯的抑制作用,在大腸桿菌不同生長期加入BsFE均能取得很好的抑制效果,且延緩期和對數期的效果優于穩定期。試驗表明BsFE能增加大腸桿菌細胞膜的通透性,同時經BsFE作用后的細胞表面粗糙,邊緣模糊,細胞膜破裂。BsFE經Sephadex LH-20柱和液相制備色譜分離后得到三個具有抑菌活性的組分,初步成分分析顯示可能是多烯類化合物和脂肽類化合物。本試驗結果為枯草芽孢桿菌及其抑菌物質的進一步開發和研究提供了一定理論基礎和科學依據。