三種茶葉中多酚提取物的抑菌活性及其對致病菌膜滲透性的比較分析

, ,,,,紫薇

(哈爾濱商業大學藥學院,細胞與分子生物學研究所,黑龍江哈爾濱 150076)

茶葉在我國具有悠久的歷史,飲茶不僅可以提神醒腦還可以保健養生,深受人們的喜愛。茶多酚(Tea polyphenol,TP)是茶葉中多酚類物質的總稱,又叫茶單寧或茶鞣質,主要包括黃烷醇(兒茶素)類、黃酮類、黃酮醇類、花色苷類和酚酸類等,其中兒茶素占60%～80%[1]。茶多酚是茶葉中有保健功能的主要成份之一[2-5],除具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、降脂、預防心血管疾病、護肝、抗衰老、調節綜合免疫能力等多種藥理作用外,還具有廣譜而強效的抗菌作用,具有廣闊的開發應用前景[6]。

目前,人們對于茶多酚及其抗菌作用的研究主要是茶多酚抗菌特性的研究,集中在茶多酚抑菌的種類、抑菌效果與影響因素等[7]。茶多酚對多種典型食品致病菌及腐敗菌都有抑制作用,且與多種已知抗生素具有協同作用[7]。但是,對于不同種類茶葉的抑菌活性比較、茶多酚與細菌相互作用的研究還非常有限。另外,目前國內外對于茶多酚抑菌機制尚不十分清楚,使得茶多酚的應用缺乏科學的依據和指導,很大程度上限制了茶多酚在食品和醫藥領域的進一步推廣。

由于生活在不同地域的人們對于茶葉的種類有所偏好,本文通過比較西湖龍井(綠茶)、鐵觀音(青茶)、普洱(黑茶)茶多酚的抑菌作用,并通過DNA滲透性實驗評價茶多酚對各種致病菌細胞膜完整性的影響,進一步提取基因組DNA觀察茶多酚提取物作用細菌前后對其DNA損傷的影響,并比較茶多酚提取物作用前后菌體蛋白和上清蛋白的變化,為茶多酚的深入研究和開發應用提供理論依據,為人們保健茶飲的選擇及茶葉中活性成分的開發應用提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 8739)、金色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusATCC 6538);枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6633)、腸炎沙門氏菌(SalmonellaenteritidisATCC13076)、銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaATCC 14442)、變異鏈球菌(StreptococcusmutansATCC 35668) 哈爾濱商業大學細胞與分子生物學研究所保存;西湖龍井 杭州茶廠有限公司;鐵觀音 杭州憶江南茶葉有限公司;普洱茶 云南茶樹王茶葉有限公司;茶多酚標準品(≥98%) 西安玉泉生物科技有限公司;氨芐青霉素 Sigma;細菌DNA提取試劑盒、SDS、聚丙烯酰胺、1Kb DNA ladder 天根生物科技有限公司;營養肉湯培養基、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;其它試劑 均為分析純。

FUSION FX5凝膠成像系統 VILBER;SX-700型高壓滅菌鍋 TOMY;ELx800酶標儀 BioTek;HALO DB-20紫外分光光度計 Dynamica;潔凈工作臺HDL北京東聯哈爾儀器有限公司;BP-9082精密恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多酚的提取及含量測定 采用熱水浸提法,茶葉干品經粉碎機粉碎后,過80目篩,料液比1∶20 g/mL,80 ℃,浸提30 min,重復3次,合并提取液后抽濾除渣,取濾液用等體積氯仿萃取,上層為茶多酚水溶液層,下層為氯仿層,重復3次。氯仿相用乙酸乙酯萃取,將乙酸乙酯層通過旋轉蒸發儀(45 ℃，100 r/min)濃縮后揮發,得到茶多酚浸膏粗品。

取茶多酚標準品,配制濃度為0.1 mg/mL茶多酚溶液,分別取0、200、400、600、800 μL于容量瓶中,用蒸餾水定容至20 mL。再次稀釋,使茶多酚標準品濃度為0.00025、0.0005、0.00075、0.001 mg/mL。以蒸餾水為對照,分別測得274 nm下的吸光光度值。以吸光度A對茶多酚標準的濃度繪制工作曲線,帶入所提取茶多酚的吸光度值求得濃度,并計算茶多酚的含量。茶多酚的標準曲線為Y=754.8x+0.017,R2=0.9997,根據標準曲線方程計算茶多酚的濃度C。

式(1)

式中:M為茶葉粗粉質量(g);C為茶多酚溶液濃度(mg/mL);V-茶多酚溶液體積(mL)。

1.2.2 茶多酚提取物抑菌活性的測定

1.2.2.1 抑菌圈的測定 采用濾紙片法對不同茶葉中茶多酚提取物進行抑菌活性研究。用打孔器將定性濾紙打成6 mm直徑的圓片,置于培養皿中滅菌,無菌條件下在營養瓊脂培養基上涂布100 μL濃度107CFU/mL致病菌菌懸液,反復涂布3次使菌液涂布均勻,將浸泡30 min茶多酚提取液(4 mg/mL)的滅菌濾紙片擺放于培養基上,陽性對照為氨芐青霉素(0.4 mg/mL),37 ℃培養24 h后,觀察記錄結果,測量每一個抑菌圈的直徑[8]。

1.2.2.2 MIC和MBC的測定 最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,簡稱MIC),指能夠抑制細菌生長、繁殖的最低藥物濃度。通過二倍肉湯稀釋法,采用96孔板,對茶多酚提取物進行抑菌活性研究,將茶多酚提取物溶于生理鹽水,倍比稀釋,得到樣品濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL。分別加入105CFU/mL的致病菌,包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌、銅綠假擔孢菌、變異鏈球菌,37 ℃過夜培養12 h,觀察菌液生長情況,菌液透明澄清時所對應的藥液濃度即為MIC[9],實驗重復3次。

最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration)簡稱MBC,指殺死99.9%的供試微生物所需的最低藥物濃度。MBC是根據MIC的測定結果,選取MIC、2MIC和4MIC對應樣品的菌液,并點植于營養瓊脂培養基上,37 ℃過夜培養12 h,觀察病原菌生長狀況,不生長菌落對應的最低藥物濃度即為MBC[10]。

1.2.3 細胞膜滲透性實驗 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、腸炎沙門氏菌、銅綠假擔孢菌、變異鏈球菌6種致病菌接種于營養肉湯于37 ℃ 120 r/min過夜培養至107CFU/mL,培養液經12000 r/min,離心2 min,棄上清,沉淀用0.5% NaCl溶液洗滌、重懸。分別加入3種不同濃度的茶多酚提取物(0.5MIC、MIC、2MIC),空白對照加入等體積的0.5% NaCl,37 ℃培養8 h,12000 r/min,離心2 min,取上清。在260 nm下測量紫外分光光度值[11]。實驗重復3次。

1.2.4 DNA損傷實驗 取過夜培養至107CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養液,12000 r/min,離心2 min,棄上清,菌體用0.5% NaCl洗滌、重懸后,加入不同濃度的茶多酚(0.5MIC、MIC、2MIC),充分混勻37 ℃培養12 h。用細菌DNA試劑盒提取基因組DNA。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測,凝膠成像系統觀察不同濃度茶多酚對致病菌基因組DNA的損傷作用[12]。

1.2.5 蛋白質損傷及泄露實驗 取過夜培養至107CFU/mL的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養液,12000 r/min,離心2 min,棄上清,菌體用0.5% NaCl洗滌、重懸后,加入不同濃度的茶多酚(0.5MIC、MIC、2MIC),充分混勻37 ℃培養12 h。12000 r/min,離心2 min后,將菌體蛋白與上清蛋白分別加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)中,100 ℃水浴5 min,使之完全混合變性,用12%分離膠(1.5 mol/L Tris-HCl pH=8.8,10% SDS,10%過硫酸銨(APS),30 mol/L Tris-HCl,N,N,N,N四甲基乙二胺(TEMED),ddH2O)和4%濃縮膠(1.0 mol/L Tris-HCl pH=6.8,10% SDS,10% APS,TEMED,ddH2O)進行凝膠電泳。加樣后,100 V為起始電壓10 min后,120 V恒壓1 h,考馬斯亮藍R-250染色約15 min,再用脫色液脫色,觀察菌體及上清蛋白條帶變化。

1.3 數據處理

應用SPSS統計軟件包進行數據統計學處理。采用ANOVA方差分析并行方差齊性檢驗;結果以均值±標準差(n=3)表示。

2 結果與分析

2.1 茶多酚的含量

根據茶多酚含量計算公式得出西湖龍井、鐵觀音和普洱茶的茶多酚的含量分別為(48.12±3.22)、(37.36±2.64)和(31.61±1.92) mg/g,其中西湖龍井中的茶多酚含量最高。

2.2 茶多酚提取物的抑菌活性

從表1可以看出,三種茶葉中茶多酚提取物均具有明顯的抑菌效果,其中西湖龍井抑菌效果最強,可通過進一步MIC和MBC的測定對抗菌效果進行評價。

表1 茶多酚提取物對致病菌抑菌直徑的影響(cm)Table 1 Effect of tea polyphenol extract on antipathogenic bacteria diameter(cm)

從綜合表1～表2中分析可知,3種茶葉茶多酚提取物均對6種常見致病菌具有較好的抑菌效果,其中西湖龍井與鐵觀音的抑菌效果最強,對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的MIC值為0.125、0.125 mg/mL,MBC值為0.25、0.25 mg/mL。由于表1中顯示西湖龍井抑菌效果更明顯,對金黃色葡萄球菌抑菌直徑為(1.80±0.06) cm,結合抑菌圈直徑、MIC和MBC結果及茶多酚含量推測,抑菌效果與茶多酚的含量具有一定的相關性,隨著茶多酚含量的增加,抑菌效果更為明顯。后續實驗選取茶多酚含量較高的西湖龍井茶多酚提取物做進一步研究。

表2 茶多酚提取物的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)(mg/mL)Table 2 MIC and MBC value of tea polyphenol extract(mg/mL)

2.4 細胞膜滲透性試驗

選取西湖龍井茶多酚提取物為研究對象,通過對6種細菌培養物作用后,在260 nm下測量OD值,如圖1所示,在茶多酚的作用下,隨著藥物濃度的增加,260 nm處的以DNA為主滲透物質含量逐漸升高,尤其是作用在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及變異鏈球菌中變化較為明顯。有報道顯示，兒茶素物質可結合細胞膜的磷脂雙分子層,從而導致細胞膜的破壞。細菌細胞膜的破壞可削弱細菌與宿主細胞結合的能力,同時也抑制了細菌聚集結合形成生物膜,生物膜的形成與細菌的致病性和耐受性密切相關[13]。推測茶多酚提取物的抑菌作用與破壞細菌細胞膜并提高其滲透性有著一定的關聯。

圖1 茶多酚提取物的菌株DNA滲透性實驗Fig.1 DNA permeability test of tea polyphenol extract on strain

2.5 DNA損傷實驗

根據DNA滲透性實驗結果,選取西湖龍井茶多酚提取物為研究對象,作用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,經藥物作用后提取基因組DNA,發現隨著藥物濃度的增加,無論是革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌,其基因組DNA均呈現一定程度的彌散和降解,如圖2所示,推測茶多酚提取物可能通過破壞細菌細胞膜,進一步對細菌DNA造成損傷,進而發揮其抑菌作用。

圖2 茶多酚提取物的菌株DNA損傷實驗Fig.2 DNA damage test of tea polyphenol extract on strain注:1～5為1kbDNA marker,2MIC、MIC、0.5MIC、空白組金黃色葡萄球菌DNA;6～10為DNA marker,2MIC、MIC、0.5MIC、空白組大腸桿菌DNA。

2.6 蛋白質損傷及泄露實驗

選取西湖龍井茶多酚提取物為研究對象,作用于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌,經藥物作用后,隨著藥物濃度的增加,金黃色葡萄球菌的菌體蛋白出現一定程度的降解損傷,其中條帶a與條帶b可能對茶多酚更為敏感,蛋白表達具有較明顯的下降趨勢。隨著藥物濃度的增加,菌體上清蛋白中c條帶與d條帶具有表達上揚趨勢,但當藥物濃度達到MIC以后,降解程度不再增加,說明菌體細胞膜隨藥物濃度增大逐漸發生損傷,引起菌體蛋白的泄露,當藥物濃度達到一定值時,蛋白泄漏處于相對穩定狀態(圖3A)。大腸桿菌的菌體蛋白隨藥物濃度有輕微的降解損傷,變化不明顯。在對菌體上清蛋白的觀察中發現e條帶、f條帶與g條帶出現一定的上揚趨勢,表明菌體上清蛋白出現一定程度的泄漏,尤其是當藥物濃度達到MIC時,菌體蛋白泄漏程度最大,隨著藥物濃度繼續加大,反而蛋白質泄漏不再增加(圖3B)。這一現象可能與革蘭氏陽性菌與陰性菌的細胞壁結構有關。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,其細胞壁存在外膜結構,對細菌細胞膜起到一定的保護作用。

圖3 茶多酚提取物的對菌體蛋白損傷及上清蛋白泄露實驗Fig.3 The experiment of tea polyphenol extract on protein-damage and supernatant leakage注:A中M:蛋白質marker,1～4:2MIC、MIC、0.5MIC、空白組金黃色葡萄球菌菌體蛋白,1′-4′:0.5MIC、MIC、2MIC空白組金黃色葡萄球菌上清蛋白;B中M:蛋白質 marker,1-4:2MIC、MIC、0.5MIC、空白組大腸桿菌菌體蛋白,1′-4′:0.5MIC、MIC、2MIC空白組大腸桿菌上清蛋白。

3 討論

茶葉作為一種保健飲品有著悠久的歷史,不同的茶葉中其保健成分與保健效果也有著一定的差異。茶葉組成成分由于不同種類的茶葉發酵程度不同,其成分含量也不同。其中綠茶為不發酵茶,青茶為半發酵茶,黑茶為后發酵茶。在發酵過程中,由于酶的作用,使得茶葉中的一些成分發生氧化和降解。特別是茶葉中多酚類物質,由于酶的氧化逐漸產生茶紅素、茶黃素和茶褐素[14-17]。因此,對黑茶來說,茶色素含量增多,茶多酚含量減少。

茶多酚中主要成分為兒茶素類,包括表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)和表兒茶素沒食子酸酯(ECG)4種。曾亮等[18]研究發現,兒茶素對革蘭氏陽性菌的抑制率比陰性菌高,效果更加明顯。熱穩定性測定發現當溫度為25～80 ℃時,兒茶素的抑菌效果最好,且不受溫度的影響。兒茶素在酸性條件下比在堿性條件下穩定。研究也證實,茶多酚可抑制或殺死金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌、百日咳桿菌、痢疾桿菌和霍亂弧菌等[19]。

研究表明,不同種類的細菌對多酚的耐受力不同,取決于多酚類物質結構以及細菌種類。茶多酚的4種主要兒茶素物質由于結構不同,其抗菌活性也不盡相同,表現出的抗菌活性強弱順序為 EGCG>ECG>EGC>EC[20]。茶多酚一般為含有兩個以上互為鄰位的羥基多元酚,其基本結構是C6-C3-C6碳架,酯型兒茶素較簡單兒茶素的抑菌效果更強,其分子結構中比簡單兒茶索多結合1～2個沒食子?；?。其抑菌機理為茶多酚結構中的酚羥基可與蛋白質分子中的氨基或羧基結合,其疏水性的苯環結構也可與蛋白質發生疏水結合,茶多酚與蛋白質之間的這種多點結合作用阻止了細菌的侵染,使其具有抑菌性?！H基團與菌體內的二氫葉酸合成酶肽鍵上的氨基酸殘基結合,使二氫葉酸合成酶失活,影響細菌的核酸合成,進而使細菌的生長繁殖受到抑制[21]。

本研究結果表明,3種茶葉茶多酚提取物中,抑菌效果最強的為綠茶,之后為青茶,最后為黑茶,與華德興[22]的研究結果一致。茶葉中的主要抑菌成分為茶多酚,茶多酚含量的高低與抑菌作用的強弱有關。茶多酚也能夠促進細菌細胞膜滲透性的發生,使其內容物發生泄露,并且使細菌DNA及菌體蛋白發生一定程度的損傷。對于茶多酚中主要的化合物:EC、EGC、EGCG和ECG抑菌作用比較及機制的研究也是我們課題組今后關注的內容。

4 結論

通過對西湖龍井、鐵觀音和普洱茶三種茶葉進行茶多酚的提取、抑菌活性比較以及細胞膜滲透性實驗,結果顯示，西湖龍井茶多酚提取物抑菌效果最優。隨著茶多酚提取物濃度的增加,260 nm下的細菌滲透性物質逐漸增多,并且基因組DNA的損傷程度逐漸增大,菌體蛋白質發生一定程度的損傷,且在革蘭氏陽性菌中損傷更明顯。本實驗表明，不同種類茶葉中茶多酚含量與其抑菌效果有關,為深入研究茶葉保健功能及抑菌機理研究提供了實驗依據。