紅鰭東方魚皮膠原低聚肽螯合鈣工藝優化

, ,,,, ,劉英,*

(1.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000; 2.河北農業大學海洋學院,河北秦皇島 066000)

紅鰭東方鲀肉質鮮美,是典型的高蛋白低脂肪的魚類,營養價值很高。近年來,隨著人工繁殖河豚技術的發展和苗種的成功培育,我國的紅鰭東方鲀達到了無毒級,紅鰭東方鲀成為了我國最大的養殖河豚魚種之一[1]。膠原蛋白肽具有抗氧化、促進傷口愈合、降血壓以及美白補水等多種生理功效[2-5],有研究指出，河豚魚皮中的膠原蛋白含量占總蛋白含量的90%左右[6],含量豐富,如果能充分利用其膠原蛋白含量高這一特性,對魚皮進行深加工,不僅能提高其利用價值，獲得良好的經濟效益,還能減少浪費，避免環境污染。

鈣主要是以磷酸鈣的形式存在于人體的骨骼中,目前市場上的補鈣產品主要有碳酸鈣、乳酸鈣、葡萄糖酸鈣等,人體對這種電離鈣的吸收率較低，且如果補充電離鈣過度會影響人體健康,如出現便秘、脹氣、腹脹的不良反應等[7]。膠原蛋白肽螯合鈣有望能克服電離鈣的缺點:低濃度水平下的低吸收率和生物利用率以及高濃度水平下的生物毒性[8]。研究表明，人體對鈣的吸收是通過小腸刷狀緣分泌的氨基酸和小肽與Ca2+螯合成氨基酸或肽螯合物被小腸吸收進入人體[9-11],膠原蛋白肽能刺激軟骨細胞合成膠原蛋白并影響膠原在骨關節中的轉化,因此膠原蛋白肽螯合鈣不僅促進人體對鈣的吸收,還能發揮出膠原蛋白肽的功效[12-13]。梁春輝等[14]比較了膠原多肽螯合鈣、葡糖糖酸鈣和碳酸鈣對小鼠的壯骨作用,發現膠原蛋白肽螯合鈣對小鼠壯骨作用最為顯著。目前已經有從鱈魚皮、白鰱魚骨、牡蠣、羅非魚皮、魚鱗、豬皮、牛骨等中提取的膠原蛋白進行金屬螯合的報道以及各種氨基酸螯合金屬的研究[15-22]。從河豚魚皮提取膠原寡肽的研究較少,目前沒有關于河豚魚皮膠原寡肽螯合鈣的報道。

本研究以紅鰭東方鲀魚皮為原料，分析了反應pH、肽鈣質量比、反應時間、反應溫度及膠原蛋白小肽濃度這五個因素對螯合率的影響,選取對螯合率影響最顯著的三個因素進行響應面優化,確定出最佳工藝條件,并通過紅外光譜、紫外掃描對螯合物進行了結構分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅鰭東方鲀魚皮 秦皇島;酸性蛋白酶 北京奧博星生物技術有限責任公司;氯化鈣 天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鉀、硫化鈉 天津市歐博凱化工有限公司;檸檬酸鈉 天津市凱通化學試劑有限公司;鈣試劑 天津市致遠化學試劑有限公司；分子量不同的膠原蛋白肽 實驗室自制。

TGL-18M離心機 上海盧湘儀器有限公司;pH-3C pH計 上海精科有限公司;UV-1700PC紫外可見分光光度計 上海美析儀器有限公司;IRAffinity-1S傅里葉紅外檢測器 島津有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原蛋白肽的制備 絞碎后的魚皮經過前處理,在60 ℃水浴中提取6 h,紗布過濾除去魚皮,冷凍干燥得到膠原蛋白。在料液比1∶40 g/mL,加酶量5%,pH3的條件下利用酸性蛋白酶酶解3 h,100 ℃水浴滅酶活,7000 r/min離心得上清液,經超濾得到不同分子質量范圍的膠原蛋白肽。

1.2.2 膠原低聚肽螯合鈣制備方法 取適量膠原蛋白肽溶于水中,0.1 mol/L的鹽酸和0.1 mol/L NaOH調pH,加入適量的氯化鈣,控溫螯合,9倍體積的無水乙醇沉淀,沉淀20 min,7000 r/min離心10 min,去上清液,乙醇反復多次沖洗沉淀,真空冷凍干燥。

1.2.3 螯合率的測定 參照GB/T 5009.92-2016中的EDTA滴定法測定膠原低聚肽螯合鈣中的鈣含量。

取2 mL反應液加入18 mL無水乙醇,取1 mL溶液測定其鈣含量,離心后取1 mL上清液測其中的鈣含量。按照下式計算螯合率。

螯合率(%)=(反應液中鈣含量-上清液中鈣含量)/反應液中鈣含量×100

1.2.4 最適分子質量的膠原蛋白肽的篩選 Mr<1 kDa、1 kDa10 kDa的膠原蛋白肽分別用蒸餾水溶解,加入相同質量的CaCl2,在pH為7,反應溫度為50 ℃的條件下螯合50 min,測其螯合率,選取螯合率最高的分子質量的肽段進行下階段優化試驗。

1.2.5 單因素實驗 實驗考察了膠原低聚肽濃度、pH、反應時間、反應溫度、肽鈣質量比五個反應因素對該實驗的影響。

1.2.5.1 膠原低聚肽濃度對螯合率的影響 在反應溫度為50 ℃,反應時間50 min,肽鈣質量比為5∶1,反應pH為7的條件下對膠原蛋白低聚肽濃度分別為10、20、30、40、50、60 mg/mL的條件下進行單因素實驗,以螯合率為指標確定出最佳膠原蛋白肽濃度。

1.2.5.2 反應時間對螯合率的影響 設定反應溫度為50 ℃,肽鈣質量比為5∶1,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL,分別控制反應時間為10、30、50、70、90 min,以螯合率為指標確定最佳反應時間。

1.2.5.3 反應溫度對螯合率的影響 在反應時間50 min,肽鈣質量比為5∶1,反應pH為9,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL的條件下控制反應溫度為35、40、45、50、55、60 ℃進行單因素實驗,以螯合率為指標確定最佳反應溫度。

1.2.5.4 pH對螯合率的影響 設定反應溫度為50 ℃,反應時間50 min,肽鈣質量比為5∶1,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL,分別在pH為5、6、7、8、9、10、11進行實驗,以螯合率為指標,確定出最佳pH。

1.2.5.5 肽鈣質量比對螯合率的影響 設定反應溫度為45 ℃,反應時間50 min,反應pH為9,膠原低聚肽濃度為40 mg/mL的條件下控制肽鈣質量比分別為1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1進行單因素實驗,以螯合率為指標確定最佳肽鈣質量比反應條件。

1.2.6 響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上按照Box-Behnken 中心組合設計原理對此工藝進一步優化,響應面編碼設計見表1。

表1 中心組合實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of Center combination of experiment

1.2.7 膠原低聚肽螯合鈣的紫外檢測分析 將膠原低聚肽和膠原低聚肽螯合鈣分別配制成濃度為2 mg/mL的樣品,用紫外分光光度計在波長為200～400 nm的范圍內進行紫外掃描。

1.2.8 膠原低聚肽螯合鈣的紅外光譜分析 將膠原低聚肽和膠原蛋白低聚肽螯合鈣分別于干燥的KBr按照一定的比例進行混合、研磨、壓片,利用傅里葉紅外光譜儀在4000～500 cm-1的范圍內進行掃描得到紅外光譜圖。

1.3 數據分析

本試驗應用excel軟件繪制折線圖,應用Design-expert. V8.0.6軟件進行響應面設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 不同肽段螯合鈣的螯合率

分子量較小的膠原蛋白肽能暴露出更多的基團與鈣離子發生螯合反應,由圖1可知，分子量小于1 kDa的肽與鈣的螯合效果最好,螯合率達到50.52%,遠遠高于其他分子量的肽段,因此選擇分子量小于1 kDa的膠原低聚肽進行螯合鈣的試驗。

圖1 不同分子量的膠原蛋白肽與鈣的螯合情況Fig.1 Chelating rate of different molecular weight collagen peptides with calcium

2.2 膠原蛋白肽螯合鈣單因素實驗

2.2.1 膠原低聚肽濃度對螯合率的影響 由圖2可知,隨著膠原低聚肽濃度的升高,螯合率呈現先上升后下降的趨勢,并在膠原低聚肽濃度為40 mg/mL時達到最大。當膠原低聚肽濃度較小時,溶液中的肽含量較少，不能與大量的鈣離子充分結合,當膠原低聚肽濃度增加到一定值時,肽含量達到飽和,膠原低聚肽中的-NH+和-COO-與鈣離子螯合時會產生競爭,使肽與鈣離子的配位降低,螯合率下降。因此選擇40 mg/mL的膠原低聚肽為最佳螯合濃度。

圖2 膠原低聚肽濃度對螯合率的影響Fig.2 Effect of collagen peptide concentration on chelating rate

2.2.2 反應時間對螯合率的影響 由圖3所知,在所選擇的時間段內螯合率變化較小,可見時間對膠原低聚肽和鈣離子的螯合效果影響較小。因此，響應面試驗中不再研究時間對膠原低聚肽和鈣離子螯合反應的影響。

圖3 時間對螯合率的影響Fig.3 Effect of time on chelating rate

2.2.3 反應溫度對螯合率的影響 由圖4可以看出,肽鈣螯合率隨著反應溫度的變化呈現先上升后下降的趨勢,在45 ℃達到最大值。隨著反應溫度的升高,分子間的運動加劇,碰撞幾率增大有利于螯合反應的進行,而當溫度繼續升高,對多肽的性質有一定影響,并且溫度較高，螯合物不穩定易分解，使螯合率降低[23]。因此最適反應溫度為45 ℃。

圖4 反應溫度對螯合率的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on chelating rate

2.2.4 pH對螯和率的影響 當pH較低時,溶液中的H+含量較高,會影響肽中的-COOH電離,同時較多的H+會和Ca2+爭奪供電子基團-COO-,使螯合率降低。在pH到達9～10時,溶液處于偏堿狀態,OH-較多,有利于-COOH的電離生成H+,以及-NH2和OH-發生反應生成-NH-,從而有利于和鈣離子的螯合[24],當pH繼續上升，溶液中的OH-會和低聚肽供電子集團爭奪Ca2+,生成Ca(OH)2,不利用螯合反應。因此最適反應pH為10。

圖5 pH對螯合率的影響Fig.5 Effect of pH on chelating rate

2.2.5 肽鈣質量比對螯合率的影響 由圖6可見,肽鈣質量比是影響肽鈣螯合率的一個重要因素,隨著肽鈣質量比的提高,螯合率也呈上升趨勢,在質量比為25∶1之后，螯合率趨于平緩。若肽鈣質量比過小,則氯化鈣添加過量,沒有足夠的基團和鈣離子絡合,螯合率較低;若肽鈣質量比過大,則氯化鈣添加量小,螯合反應不完全,浪費膠原低聚肽。螯合率相似時,氯化鈣添加量越少,膠原低聚肽螯合鈣產物中鈣含量越低,所以本試驗選擇15∶1、20∶1、25∶1三個水平的質量比進行響應面試驗。

圖6 肽鈣質量比對螯合率的影響Fig.6 Effect of peptide-calcium mass ratio on chelation rate

2.2 響應面設計試驗結果及分析

表2 響應面分析設計及結果Table 2 Design and results of response surface analysis

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱,橢圓形表示兩因素間交互作用較強,圓形則表示較弱[25]。同時,等高線越稠密，說明此因素對肽鈣螯合率的影響較強,越稀疏,說明該因素對肽鈣螯合率的影響越弱。圖7可以得出，溫度和肽鈣質量比的等高線呈橢圓形,交互作用顯著。

圖7 各因素交互作用對螯合率影響的響應面圖Fig.7 Response surface of interaction of various factors on chelation rate

由圖7a可見,當pH固定時,螯合率呈現先上升后下降的趨勢,在溫度為45 ℃左右時達到最高;當溫度固定時,螯合率在pH為9左右時達到最高;由圖7b可見,當肽鈣質量比固定時,螯合率在pH為9左右時達到最高,當pH固定時,螯合率在肽鈣質量比為20∶1左右時達到最高;圖7c反映了溫度和肽鈣比交互作用對螯合率的影響,從響應面圖可以看出,當肽鈣質量比固定時,螯合率在45 ℃時達到最高,當溫度固定時,螯合率呈現先上升后下降的趨勢,在肽鈣質量比為20∶1時達到最高。

模型得到的最優螯合條件是pH為9.18,肽鈣質量比為20.55∶1,反應溫度為45.27 ℃,在此條件下預測螯合率為89.98%?？紤]到實際條件將反應溫度設定為45.3 ℃進行試驗驗證此模型,得到的結果是螯合率為91.04%,與預測值接近。

2.3 紫外光分析

膠原低聚肽及膠原低聚肽螯合物的紫外吸收波長如圖8所示,膠原低聚肽在226 nm處有最大吸收波長,膠原低聚肽螯合鈣最大波長遷移至208 nm處,最大吸收峰發生了明顯的移位,而膠原蛋白肽在200～230 nm處的吸收峰是膠原多肽的羰基及肽鍵的特征吸收峰。膠原低聚肽與鈣離子螯合后相應原子的價電子躍遷使其最大吸收波長發生了改變,說明了膠原低聚肽與鈣離子發生了螯合反應。

圖8 膠原低聚肽與膠原低聚肽螯合鈣紫外可見光波長掃描Fig.8 UV-visible wavelength scanning of collagen oligopeptide and collagen oligopeptide calcium-chelating calcium

2.4 紅外光譜分析

膠原蛋白酶解物的紅外光譜分析圖中會出現-NH2和-COOH的吸收峰,當這些基團與鈣離子螯合后,吸收峰會發生改變或偏移[26]。由圖9可見,在酰胺A帶膠原低聚肽紅外光譜特征區,由于N-H伸縮振動,-NH2在3311.78cm-1處具有吸收峰,而在膠原低聚肽螯合鈣中此吸收峰移至3315.63 cm-1;在酰胺Ⅰ帶,因為COO-的震動收縮,C=O在1654.92 cm-1處具有吸收峰,而膠原低聚肽螯合鈣的C=O吸收峰移至1660.71 cm-1[26]。酰胺A帶和在酰胺Ⅰ帶都向高波數方向移動,且兩個區的吸收強度顯著增強,說明氨基和羧基都與鈣離子發生了螯合反應。

圖9 膠原低聚肽和膠原低聚肽螯合鈣的紅外光譜圖對比Fig.9 Comparison of the infrared spectra of collagen oligopeptide and collagen oligopeptide calcium-chelating calcium

3 結論

通過單因素實驗分析了pH、溫度、反應時間以及肽鈣質量比對膠原低聚肽和鈣離子螯合作用的影響,然后選定pH、溫度、肽鈣質量比進行響應面優化試驗,得到的最優螯合條件是pH為9.18,肽鈣質量比為20.55∶1,反應溫度為45.3 ℃,在此條件下螯合率為91.04%,與預測值接近,響應面優化的最優工藝條件可靠,可以用于實踐。對膠原寡肽螯合鈣通過紫外吸收光譜和紅外光譜分析,發現膠原低聚肽螯合鈣的吸收峰發生了位移,膠原低聚肽的氨基和羧基與鈣發生了螯合反應,證明膠原低聚肽與鈣生成膠原低聚肽螯合鈣。