微波輔助提取梔子皂甙的工藝優化及其抗氧化性

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(溫州大學生命與環境科學學院,浙江溫州 325027)

梔子是茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實,作為中國傳統的中藥藥材,在臨床中被應用于保肝利膽藥,歷代本草經中亦有記載其效用。梔子性味苦寒,入心、肺、三焦經,具有清熱瀉火、利濕除煩、涼血解毒和抗氧化等功用[1-2]。梔子中含有多種化學成分,主要包括單萜、三萜(梔子花酸類)、黃酮(梔子素類)、環烯醚萜類(梔子甙類)、藏紅花素、有機酸及揮發油等等。其中梔子皂甙為梔子的主要活性物質之一,具有消炎、鎮痛、瀉下、保肝、解熱等作用,在醫學上可用作抑菌劑、清熱解毒劑等,廣泛運用于醫藥研究、病理試驗等方面,有很高的藥用價值[3]。

目前，國內外皂甙的提取方法有很多,如乙醇提取法、水提取法和樹脂吸附法等[4],但這些方法存在流程長、浪費率高以及提取率低等問題;吳亞超等[5]利用超聲波輔助提取梔子皂甙,提取梔子苷含量較藥典法高3.98%;王建輝等[6]將微波輔助萃取法應用于絲蘭皂甙乙醇浸提中,時間縮短80%,提取率提高41.56%;賀曉龍等[7]總結了微波輔助提取百合總皂甙的優點,即萃取效率高、提取時間短、設備簡單、溶劑消耗低和污染小等,但是都沒有系統闡述微波輔助提取皂甙參數模型和最佳的提取條件。本試驗綜合文獻資料,采用微波輔助的方法來提取梔子皂甙,以單因素實驗(微波功率、微波時間、浸提時間、浸提溫度、液固比、乙醇濃度)為基礎,選出影響梔子皂甙得率最大的四個因素作為考察對象,采用了Box-behnken響應面法分析梔子皂甙提取的最優條件,提取的梔子皂甙與抗壞血酸作對比,探究梔子皂甙的抗氧化能力,旨在為開拓具抗氧化能力的天然皂甙提供相應的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梔子果實 購于溫州農貿市場,120 ℃烘干機器粉碎過后過50目篩,得梔子粉末;薯蕷皂甙標準品 純度>98%,上海永葉生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 純度>98%,美國Sigma 公司;抗壞血酸 分析純,廣州萬從化工有限公司;乙醇、三氯甲烷、冰醋酸、高氯酸、鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、磷酸二氫鈉 均為國產分析純。

HH-S型數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠;80-2型臺式低速離心機 金壇市順華儀器有限公司;UV-722型可見分光光度計 上海欣茂儀器有限公司;NJL07-3型實驗專用微波爐 南京杰全微波設備有限公司;TG-328A型分析天平 上海試驗儀器廠;SHZ-Ⅲ型臺式循環水式真空泵 上海英化儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 梔子皂甙的提取 根據文獻[8]準確稱取梔子粉末1.00 g,按一定的比例溶于一定濃度的乙醇溶液中,在一定的微波功率下處理一定時間,在一定溫度下,浸提一定時間后,過濾得到的清液,用鹽酸調pH至1～2、靜置過濾得沉淀物,再用NaOH溶液調至溶解后,加入95%乙醇攪拌過濾,最后再次用鹽酸調pH至1～2,過濾得梔子皂甙結晶。

1.2.2 單因素實驗設計 固定乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,微波時間40 s,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設置液固比為5∶1、10∶1、20∶1、30∶1、40∶1 (mL/g),考察固液比對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波時間40 s,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設置微波功率為150、300、450、600、750(W),考察微波功率對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設置微波時間為10、20、30、40、50(s),考察微波時間對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,微波時間40 s和浸提時間5 min,分別設置浸提溫度為20、30、40、50、60 ℃,考察浸提溫度對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),乙醇濃度80%(V/V),微波功率450 W,微波時間40 s和浸提溫度20 ℃,分別設置浸提時間為5、10、15、20、25 min,考察浸提時間對梔子皂苷得率的影響;

固定液固比10∶1 (mL/g),微波功率450 W,微波時間40 s,浸提時間5 min和浸提溫度20 ℃,分別設置乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%(V/V),考察乙醇濃度對梔子皂苷得率的影響;每個實驗平均三次,結果取平均值。

1.2.3 響應面優化試驗設計 在單因素實驗的基礎上,考慮到乙醇濃度和微波功率對梔子皂甙得率影響相對較小,因此恒定乙醇濃度為80%,微波功率為450 W,采用Box-Behnken設計方法,以皂甙得率(Y)為響應值,以液固比(X1)、微波時間(X2)、浸提時間(X3)和乙醇濃度(X4)這4個因素為自變量進行響應面優化試驗,具體因素水平見表1。

《普通高中數學課程標準(實驗)》強調：“數學教學要使學生通過不同形式的自主學習、探究活動，體驗數學發現和創造的歷程.”從數學學科特點出發,根據不同的教學內容,有效合理地組織學生開展“探究教學”，是追求有效教學、構建高效課堂的重要途徑.在目前課堂教學中，“探究教學”中探究的成分太少,有種“貼標簽”的嫌疑.筆者認為，數學課堂教學過程中的每一個環節都可以滲透探究的元素、探究方法、探究思想.我們應力求讓探究成為數學課堂教學的常態,應善于把握課堂教學中的每一個探究機會和細節，使數學探究逐步成為學生學習的自覺行為乃至形成習慣,促進學生思維充分、健康、全面發展.

表1 響應面因素及水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis

1.2.4 梔子皂甙得率的計算

1.2.4.1 溶液的配制 薯蕷皂甙標準對照液配制:精確稱取薯蕷皂甙標準品固體1.00 mg于燒杯中,溶解于無水乙醇中,然后用無水乙醇定容到10 mL的容量瓶中,搖勻,得濃度0.10 mg/mL的薯蕷皂甙標準對照液。

5%香草醛冰醋酸溶液的配制:準確稱取5.00 g香蘭素粉末于燒杯中,加入濃度99.5%冰醋酸溶解,并定容到100 mL容量瓶中,混勻。

1.2.4.2 標準曲線的制作 根據文獻[9]的方法,量取薯蕷皂甙標準品對照液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL,分別置于10 mL具塞試管中,沸水浴一段時間直至溶劑被揮干,再將0.20 mL的5.0%香草醛冰醋酸溶液和0.80 mL的濃度99.5%高氯酸溶液加入試管中,密塞混勻,然后置于60 ℃中水浴顯色15 min,顯色完全后取出,冰水浴冷卻5 min,然后加入5.0 mL的冰醋酸溶液,均勻混合,靜置10 min。與空白試劑管對照,用分光光度計在波長544 nm處測其吸光度,橫坐標為薯蕷皂甙濃度m(mg/mL),縱坐標為吸光度A,繪制薯蕷皂甙標準曲線,得線性回歸方程為:A=0.9826m+0.0012,R2=0.9996。

1.2.4.3 得率的計算 將皂甙晶體用5.00 mL 95%乙醇溶解于具塞試管中,采用香草醛-冰醋酸-高氯酸比色法測其吸光度值,根據測得的標準曲線線方程計算梔子提取液中皂甙含量,梔子皂甙得率按式(1)計算。

式(1)

式中:Y為梔子皂甙得率,%;C為測定提取液中梔子皂甙濃度,mg/mL;V為梔子皂甙提取液體積,mL;M為梔子粉末質量,mg。

1.2.5 梔子皂甙抗氧化能力的測定

1.2.5.2 梔子皂甙還原能力的測定 取質量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的梔子皂甙溶液2.50 mL分別于10 mL離心管內,再加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鈉緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,50 ℃水浴20 min,加入2.5 mL 10%三氯乙酸后混勻,在3000 r/min離心10 min,取上清液5.0 mL再加5.0 mL水于試管中,再加1 mL 0.1%三氯化鐵,搖勻混合后,靜置10 min,在波長700 nm處測其吸光度,用抗壞血酸作比較;每個濃度均做3次平行試驗[10]。計算吸光度的平均值。

1.2.5.2 梔子皂甙對DPPH清除力的測定 分別取質量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的梔子皂甙溶液2.0 mL,加入2.0 mL用無水乙醇配制的0.8 mmol/mL DPPH溶液,用力振搖混勻后在黑暗環境中靜置30 min,于517 nm 處測定其吸光度,用抗壞血酸作比較[11];每個濃度均做3次平行試驗,DPPH自由基清除率按式(2)計算。

式(2)

式中:Ax為加入樣品溶液后的吸光度;Ax0為樣品溶液本底的吸光度;A0為空白對照液的吸光度。

1.3 數據處理

實驗操作重復三次取平均值,應用分析統計軟件采用SAS RSREG程序對試驗進行設計,并對結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 液固比對皂甙得率的影響 如圖1所示,皂甙得率隨液固比的提高呈現先升后降的趨勢,皂甙得率在液固比為20∶1 (mL/g)時達到最高,為10.03%,隨著液固比的增加會增大傳質驅動力,從而提高皂甙得率,但達到一定液固比20∶1 (mL/g)后反而減小，主要原因是浸提劑對微波能量的吸收增加,導致細胞液對微波能量的吸收減少,細胞壁的破裂不完全,皂甙不能從細胞中充分溶出[12]，因此，選擇的液固比為20∶1 (mL/g)。

圖1 液固比對梔子皂甙得率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.2 微波功率對皂甙得率的影響 從圖2可以看出,皂甙得率隨微波功率的提高呈現先升后降的趨勢,在微波功率為450 W時,提取效果最好,皂甙得率達到最大值，為7.37%。微波功率過高可能會破壞皂甙分子結構,使熱不穩定的粗皂甙提取物出現分解或部分分解現象[13],導致皂甙得率降低,而功率過低時,不能很好地破碎細胞使皂甙溶出,皂甙得率也較低。因此，選擇的微波功率為450 W。

圖2 微波功率對梔子皂甙得率的影響Fig.2 Effect of microwave power on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.3 微波時間對皂甙得率的影響 由圖3可知,隨著微波時間的延長,皂甙的皂甙得率呈現先升后降的趨勢,微波時間為40 s時,皂甙得率最高,為7.10%。原因可能是隨著微波時間的延長,溶出物增多,梔子皂甙得率增高,繼續延長微波時間,細胞膜進一步破裂,樣品中的黏液質等雜質進入浸出液,使得浸出液黏度增大,從而擴散速度緩慢,皂甙得率反而變小[12]。因此，選擇的微波時間為40 s。

圖3 微波時間對梔子皂甙得率的影響Fig.3 Effect of microwave time on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.4 浸提溫度對皂甙得率的影響 由圖4可知,皂甙得率隨浸提溫度的提高呈現先升后降的趨勢,皂甙浸提溫度為50 ℃時,皂甙得率最大，為7.86%,表明溫度越高越有利于皂甙的溶出,但是溫度太高時,梔子中皂甙有可能發生氧化分解等變化,影響試驗結果[14]。因此，選擇的浸提溫度為50 ℃。

圖4 浸提溫度對梔子皂甙得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.5 浸提時間對皂甙得率的影響 如圖5可知,皂甙得率隨浸提時間的提高呈現先升后降的趨勢,浸提時間為10 min時,皂甙得率達到最大值,為11.02%。這是因為隨著浸提時間的延長,梔子粉末與溶劑充分接觸,皂甙分子溶出增多，皂甙得率增大,浸提時間較長時，過長時間浸泡在20 ℃的溫度下,細胞膜進一步破裂,樣品中的黏液質等雜質進入浸出液,使得浸出液黏度增大,從而使其擴散速度緩慢,過濾困難，導致皂甙損失[12]。因此，選擇的浸提時間為10 min。

圖5 浸提時間對梔子皂甙得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.1.6 乙醇濃度對皂甙得率的影響 由圖6可知,皂甙得率隨乙醇濃度的增加呈現先升后降的趨勢,乙醇濃度為80%時,皂甙得率達到最大值,為7.27%,在此濃度下提取效果最好。因為乙醇極性較高對梔子皂甙的溶解度大,乙醇濃度增大皂甙溶出率較多,但過高的濃度會對皂甙造成破壞作用而降低得率,在微波作用下這種差異更為明顯[15]。因此，選擇的乙醇濃度為80%。

圖6 乙醇濃度對梔子皂甙得率的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of Gardenia jasminoides Ellis saponins

2.2 響應面法優化提取工藝結果分析

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 根據Box-Behnken方法設計響應面結果見表2,將表2的試驗數據進行處理和回歸分析,并建立二次回歸模型方程:

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Program and experimental results of response surface method

式(3)

對上述模型進行方差分析,結果見表3。此模型的p<0.0001,表明響應面模型達到極顯著,失擬項p=0.1591>0.05,不顯著,說明該模型與實際實驗擬合度良好,R2=0.9206,說明該模型能解釋92.06%實驗數據的變異性,模型的擬合良好,試驗誤差小,模型的可行度較高。因此,該模型可用于梔子皂甙微波提取的分析和預測。

表3 模型回歸方程方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression equation

2.2.2 響應面交互作用分析 響應曲面越陡峭,說明該因素對響應值改變越敏感,曲面越平滑,該因素改變對響應值影響越小[16],各因素的回歸響應面圖見圖7,由此可見,隨著微波時間(X2)和浸提時間(X3)兩因素取值改變其響應曲面線變化也越陡峭,表明這兩因素對梔子皂甙得率交互影響顯著,其它因素之間隨取值變化其響應曲面線變化較為平緩,表明其它兩兩因素的交互作用對梔子皂甙得率影響不顯著,這與表3中交互項p值的分析結果一致,由圖7還可以看出,6個響應曲面均為開口向下的凸形曲面,液固比(X1)、微波時間(X2)、浸提時間(X3)和乙醇濃度(X4)4個因素與梔子皂甙得率(Y)呈拋物線關系,且在考察范圍內存在響應值的極高值。

圖7 液固比、微波時間、浸提時間和乙醇濃度等交互作用對梔子皂甙得率的影響Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of liquid-solid ralio, microwave time,extract time and ethanol concentration on the the yield of Gardenin jasminoides Ellis

2.2.3 最佳工藝的提取與驗證 由SAS軟件綜合分析得出,梔子皂甙提取最佳條件為:液固比21.44∶1 (mL/g)、微波時間40.02 s、浸提時間9.6 min、乙醇濃度80.05%,在此條件下梔子皂甙的得率預測值為13.64%?？紤]到可行性,將以上結果校正為:液固比21∶1 (mL/g)、微波時間為40 s、乙醇濃度為80%、浸提時間為9.6 min。此條件下,重復實驗5次,梔子皂甙平均得率為13.92%±0.04%,實際得率與理論預測皂甙得率的相對誤差僅為2.05%,由此可見此模型和方法是可靠有效的。

2.3 梔子皂甙抗氧化能力測定結果

2.3.1 梔子皂甙還原能力的測定結果 由圖8可知,梔子皂甙的還原能力隨濃度的上升而增加,但遠小于抗壞血酸的還原能力,此結論與武海霞[17]發現梔子皂苷具有良好的還原能力相一致,但是遠小于抗壞血酸的還原能力的原因可能是微波輔助提取可能會對梔子皂甙的分子結構及其效用有一定的影響,從而導致其還原能力發生一定程度的改變[18]。

圖8 梔子皂甙和抗壞血酸還原能力Fig.8 Comparison of reducing power between different concentration saponins in Gardenia jasminoides Ellis and ascorbic acid

2.3.2 梔子皂甙對DPPH自由基的清除能力測定結果 由圖9可知,梔子皂甙和抗壞血酸對DPPH自由基的清除率隨其濃度的提高而增大,與濃度呈現正相關性[19],但在梔子皂甙濃度從0.05增加至0.10 mg/mL時,DPPH自由基清除率增加到38.2%,隨后增長速度趨于平緩;圖9數據顯示,相同濃度下梔子皂甙比抗壞血酸DPPH自由基清除能力要低,但清除率最高達38.2%,梔子皂甙對DPPH自由基具有一定的清除能力。

圖9 梔子皂甙和抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果Fig.9 Scavenging ability of different concentration saponins in Gardenia and ascorbic acid on DPPH

3 結論

通過單因素試驗和響應面法試驗,得到梔子皂甙提取的最佳條件為:液固比21∶1 (mL/g)、微波時間40 s、浸提時間9.6 min、乙醇濃度80%、微波功率450 W和浸提溫度50 ℃。該條件下,得到實際梔子皂甙得率為13.92%±0.04%,與理論值13.64%相近,實際得率與理論預測皂甙得率的相對誤差僅為2.05%;微波輔助法提取梔子皂甙簡便、提取得率高,回歸模型合理可靠,可用于實際預測;抗氧化活性研究表明，梔子皂甙對羥基自由基和DPPH自由基均有良好的清除能力,但其總體抗氧化性低于抗壞血酸,試驗結果表明,梔子皂甙具有一定的抗氧化能力,可進一步開發成天然抗氧化劑。