白首烏酵素發酵工藝的優化

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(江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

白首烏是蘿藦科鵝絨藤屬植物的塊根,主要產于山東、江蘇和四川等地。江蘇濱海白首烏又稱耳葉牛皮消,其含有多種活性成分和人體所有必需氨基酸等[1],具有抗腫瘤、抗衰老和保護肝臟等功效[2]。目前市售濱海白首烏的產品以首烏干片和精制首烏粉為主,該類產品的即食性較差且有明顯的藥材味。此外有研究表明,白首烏在制粉過程中有大量的營養和功效成分隨廢渣和廢液流失,這種做法既浪費原料,又污染環境,從而導致白首烏資源利用不充分、產品的附加價值降低[3]。

酵素是采用一種或多種原料,經有益菌發酵的含有多種酶和次級代謝產物等成分的發酵產品[4],研究表明[5-7]其具有調節菌群平衡、清除體內垃圾和延緩衰老等功效。Feng等[8]對不同酵素進行了綜述,表明植物酵素不僅對人類健康有益,還可以促進工業發展,其相關產品的開發具有潛在的發展前景。蔣增良等[9]從葡萄酵素中分離得到8株優勢酵母菌;張夢梅等[10]的研究表明,天然植物酵素的優勢菌種為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌。乳酸菌發酵可以產生易于人體吸收的氨基酸和乳酸菌素等物質[11],并能提供大量的活菌,有利人體消化和促進腸道健康,此外還可以改善白首烏的藥材味道;酵母菌發酵可以產SOD,該酶可以清除體內的超氧離子自由基,具有較強的抗氧化和抗衰老等作用;而醋酸菌發酵產生乙酸,不利于產品的風味,故選用乳酸菌和酵母菌作為本實驗的發酵菌種。

本文首次以純白首烏清汁為發酵基質,利用乳酸菌和酵母菌復合發酵研發了一種含有大量活菌的新型白首烏酵素。將鮮白首烏塊根或首烏干片經蒸煮、打漿、雙酶法水解和離心得到白首烏清汁,利用乳酸菌和酵母菌發酵制備酵素,此工藝可以有效減少白首烏傳統制粉過程中營養和功效成分的損失。另外,乳酸菌和酵母菌發酵分別賦予了產品大量的活性乳酸菌和功效酶,同時也極大地改善了白首烏的不良風味。此外,高附加值產品的研發為江蘇濱海白首烏資源的開發利用提供了一定的理論依據,對促進白首烏產業的發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮白首烏塊根、白首烏干片 江蘇鹽城陳氏食品有限公司;α-淀粉酶(酶活力2000 U/g)、糖化酶(酶活力100000 U/mL) 北京伊諾凱科技有限公司;嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,簡稱LA)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,簡稱LP)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,簡稱LB)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,簡稱ST) 食品生物技術實驗室提供;安琪酵母1(S1)、安琪酵母2(S2)、新良酵母(S3)、梅山酵母(S4)、尤樂博酵母(EDY) 市售;其余試劑 國藥集團化學試劑有限公司。

FA2204B電子天平 上海第二天平廠;九陽料理機 山東九陽小家電有限公司;FA25實驗室高剪切分散乳化機 上海弗魯克科技發展有限公司;501型超級恒溫水浴 上海實驗儀器廠;JJ-1型定時電動攪拌器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;WZS-Ⅰ型阿貝折光儀 上海實驗儀器廠;CR21GIII高速離心機 天美(中國)科學儀器有限公司;EL20型實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZHJH-C1209C超凈工作臺 上海智城分析儀器制造有限公司;THZ-85B氣浴恒溫振蕩器 常州翔天實驗儀器廠;DHG型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;T722型分光光度計 上海精密儀器廠;血球計數板 丹陽市健陵醫療器械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 白首烏漿料的制備 將鮮白首烏清洗干凈,去皮并切成塊狀,厚度為2～3 cm;白首烏干片以1∶3的料水比在50 ℃下復水75 min。切塊后的鮮白首烏或復水后的白首烏片于100 ℃下蒸煮30 min后按1∶9的料水比打漿,然后采用高剪切分散乳化機以10000 r/min的轉速乳化10 s,重復三次,得到漿料。

1.2.2.2 雙酶法水解 采用α-淀粉酶和糖化酶進行水解。液化條件為:α-淀粉酶添加量14 U/g、pH6.0、酶解溫度65 ℃、時間60 min;糖化條件為:加酶量160 U/g、pH4.5、溫度55 ℃、時間60 min。

1.2.2.3 發酵基質的制備 白首烏漿料酶解液于高速離心機中以8000 r/min離心30 min,得到白首烏清汁,然后調節清汁pH至6.0并滅菌備用。

1.2.2.4 菌種的活化與培養 乳酸菌的活化:取4 ℃下斜面保存的LA、LP、LB和ST于MRS培養基中,37 ℃下活化24 h,菌液待用。酵母菌活化:取一定量的干酵母于十倍體積的葡萄糖溶液(體積分數為5%)中,35 ℃下活化30 min,菌液待用。

1.2.2.5 接種與發酵 乳酸菌發酵:在白首烏清汁中分別接種3%的LA和LP,37 ℃發酵36 h,LB和ST的接種量為2%,其他條件相同。酵母菌發酵:在30 ℃、pH6.0的條件下,接種0.2%的酵母菌于裝有40 mL白首烏清汁的250 mL錐形瓶中,以130 r/min振蕩發酵24 h。按照1.2.5進行復合發酵,復合發酵結束后在4～8 ℃下低溫靜置12 h后發酵,使發酵液產香,得到白首烏酵素。

1.2.3 乳酸菌單獨發酵 為了更準確地獲得乳酸菌在白首烏清汁這種全新體系中的生長特點和基礎發酵參數,本實驗以LA、LP、LB和ST為乳酸菌發酵的菌種,在白首烏清汁中進行乳酸菌單獨發酵實驗。因為上述四種菌在白首烏清汁中生長較好,活菌數量較高,所以以活菌數為乳酸菌發酵的主要評價指標,對菌種的發酵時間和接種量進行優化,然后選擇兩種較優的乳酸菌進行配比發酵,確定最佳的復配比例。

1.2.3.1 發酵時間的確定 調整清汁初始pH為6.0,LA和LP以3%的接種量,在37 ℃下分別發酵6、12、18、24、30、36 h,結束后測定發酵液中乳酸菌活菌數。LB和ST的接種量為2%,其它條件同上。

1.2.3.2 接種量的確定 保證初始pH6.0、發酵溫度37 ℃不變,LB、ST、LA和LP分別發酵12、18、18、30 h,探究不同接種量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%)對活菌數的影響。

1.2.3.3 菌種復配發酵 由于上述得到的LA和LP的最佳發酵時間不同,故以3%的接種量,將LA和LP按照不同的比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)在37 ℃下分別發酵18、24、30 h,以活菌數為指標,確定復配比例和發酵時間。

1.2.4 酵母菌單獨發酵 為了更好地獲取酵母菌在白首烏汁中的生長特點和發酵參數,故以白首烏清汁為發酵基質進行酵母菌單獨發酵實驗。酵母菌是兼性厭氧型微生物,其發酵過程有有氧發酵和無氧發酵兩個階段,本文采用酵母菌發酵主要是為了得到較高的SOD活力,但由于無氧發酵會產生乙醇,而本課題后期會對產品的解酒功效進行研究,發酵液中乙醇含量越低越有利,所以將SOD活力和乙醇含量作為酵母菌發酵的主要評價指標。

1.2.4.1 發酵菌種和發酵時間的確定 以白首烏清汁為發酵基質,選擇5種不同來源的酵母菌(S1、S2、S3、S4、EDY)進行實驗,在初始pH6.0、裝瓶量40 mL、接種量0.2%、發酵溫度30 ℃的條件下,于130 r/min的搖床中分別發酵12、16、20、24、28 h,以SOD活力和乙醇含量為評價指標,確定最佳發酵菌種及其發酵時間。

1.2.4.2 接種量的確定 以S4為發酵菌種,在初始pH6.0、裝瓶量40 mL,30 ℃下發酵24 h,探究不同接種量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)對SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.4.3 初始pH的確定 保證裝瓶量40 mL不變,以0.2%接種量,30 ℃下發酵24 h,探究不同初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.4.4 裝瓶量的確定 酵母菌是需氧型菌種,體系含氧量對產酶能力影響較大,故在初始pH5.0、接種量0.2%、發酵溫度為30 ℃和發酵時間24 h不變的條件下,改變裝瓶量(30、40、50、60、70 mL),探究其對SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.4.5 蛋白胨添加量的確定 在裝瓶量30 mL,初始pH5.0、接種量0.2%不變的條件下,30 ℃下發酵24 h,探究不同蛋白胨添加量(0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)對SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.5 復合發酵 乳酸菌和酵母菌復合發酵有以下三種方法:a. 在初始pH為6.0的白首烏清汁中同時接種3%的復合乳酸菌與0.2%的S4,37 ℃下一起發酵一定的時間;b. 先接種3%復合乳酸菌,37 ℃發酵24 h,再接種0.2%的S4,30 ℃發酵一定的時間;c. 先接種0.2%的S4,30 ℃下發酵24 h,再接種3%復合乳酸菌,37 ℃下發酵至特定的時間。以乳酸菌活菌數、SOD活力、酵母菌活菌數和乙醇含量為評價指標,對上述三種方法進行研究,確定最佳的接種順序及該順序下的發酵時間。

1.2.6 指標測定

1.2.6.1 乳酸菌的測定 參照GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》[12]測定。

1.2.6.2 酵母菌的測定 采用血球計數板法[13],具體操作步驟為:首先,用75%的酒精和蒸餾水擦拭血球計數板(1 mm×1 mm,25×16型計數室),并用擦鏡紙擦干待用;其次,用吸管吸取一滴菌液(含亞甲基藍染色劑)于蓋玻片的邊緣,使菌液緩緩滲入,多余的菌液用吸水紙吸干,待酵母菌完全沉入計數室后用顯微鏡找到視野;最后,以計數室左上、左下、右上和右下4個中方格(100個小方格)的酵母菌數計數,每個樣品計數三次并取平均值,根據公式:酵母菌數(mL)=每個中方格中酵母菌的平均數×稀釋倍數×2.5×105計算酵母菌活菌數量。

1.2.6.3 pH 采用pH計測定發酵液的pH,按照說明書操作。

1.2.6.4 SOD活力的測定 按每克酵母濕菌體加入0.8 mL甲苯,35 ℃下破壁45 min,然后加入5 mL pH7.8的磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L EDTA)提取5 h,再以4000 r/min離心5 min,分離出水相,10000 r/min離心15 min,收集上清液即為SOD粗提取液[14]。測定方法按照GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定》[15]。

1.2.6.5 乙醇含量的測定 重鉻酸鉀分光光度法[16],具體操作如下:取兩支10 mL的比色管,一支加入0.5 mL的樣品,另一支以等量的蒸餾水代替,然后再加入2 mL的5%的重鉻酸鉀溶液,加水至刻度線,100 ℃水浴10 min,取出后立即冷卻,靜置5 min,以空白管校零,用1 cm比色皿于波長600 nm處測定吸光值。以無水乙醇為對照品,配制0.2 mg/mL的標準工作液,并繪制標準曲線,回歸方程為A=0.3668x+0.0001,相關系數為R2=0.9992。乙醇含量(g/L)=(A-0.0001)/(0.3668×0.5)×稀釋倍數。

1.2.7 數據處理 每組實驗重復三次,采用Origin 9.0進行數據處理并作圖,SPSS 21.0進行統計分析,用單因素方差分析(Duncan)對各組數據之間的差異顯著性進行分析,以p<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌單獨發酵

2.1.1 發酵時間的確定 由圖1可知,不同種類的乳酸菌達到最大活菌時的時間不完全相同,這與菌種本身的特性有關。LB發酵12 h時,活菌數達到最大,而且此時的活菌數高于其他三種菌,說明LB遲緩期較短,能盡快進入對數生長期。LA和ST的活菌數均在18 h時達到最大,LA的最大活菌數高于ST。LP發酵30 h時才達到最大活菌數,雖然發酵時間最長,但此時的活菌數與LA相近,高于LB和ST的最大活菌數。綜上可知,LB、LA、ST和LP的最佳發酵時間分別為12、18、18和30 h。

圖1 不同菌種的發酵時間對乳酸菌活菌數的影響Fig.1 Effect of fermentation time of different strains on viable LAB counts 注:LA為嗜酸乳桿菌,LP為植物乳桿菌,LB為保加利亞乳桿菌,ST為嗜熱鏈球菌；圖2和圖3同。

2.1.2 接種量的確定 由圖2可知,不同菌種達到最大活菌數時的接種量各不相同,這是不同菌種的特性決定的。當接種量為1.5%時,ST的活菌數最高,說明其最適接種量為1.5%。雖然LB在接種量為2%時活菌數達到最大,但其活菌數仍比LA和LP低。LA和LP的最佳接種量均為3%,而且兩種菌的生長趨勢相近,活菌數均較高。綜上可知,ST、LB、LA和LP的最佳接種量分別為1.5%、2%、3%和3%。

圖2 不同菌種的接種量對乳酸菌活菌數的影響Fig.2 Effect of inoculation of different strains on viable LAB counts

由2.1.1和2.1.2的結果可以看出,雖然ST和LB達到最大活菌時的接種量小于LA和LP,這有利于節約成本,但LA和LP的活菌數明顯高于LB和ST,活菌越多對產品越有利,考慮到不同乳酸菌之間可能存在共生作用,所以將LA和LP這兩種生長較好的乳酸菌進行復配發酵,期望得到較高的活菌數。LA和LP單獨發酵時均在3%的接種量下生長最好,接種量增大時活菌數減少,說明白首烏清汁中乳酸菌的總接種量為3%較合適,因此確定3%為復配發酵的總接種量。

2.1.3 復配比例和復配發酵時間的確定 由圖3可以看出,當以不同的比例發酵18 h時,LA所占的比例越大,活菌數越高,因為此時LA的生長速率比LP快,活菌數積累較多。當以不同的比例發酵30 h時,LA可能處于穩定期甚至衰退期,此時LP生長速率較快,所以LP所占比例越大,活菌數量越高。當LA∶LP為1∶1時,發酵24 h得到的活菌數高于18 h和30 h時的活菌數,其他比例下24 h的活菌數基本處于兩者之間。無論發酵18 h、24 h,還是30 h時,當LA和LP以1∶1發酵時,其活菌數始終是該時間下的最高值,可能是兩菌間存在共生作用,所以LA和LP的最佳配比為1∶1,最適發酵時間為24 h。

圖3 菌種比例和發酵時間對乳酸菌活菌數的影響Fig.3 Effect of strains proportion and fermentation time on viable LAB counts

2.2 酵母菌單獨發酵

2.2.1 發酵菌種和發酵時間的確定 由圖4可知,同一發酵時間下,不同菌種的SOD酶活力有顯著性差異(p<0.05)。隨著發酵時間的延長,不同菌種的酶活力均呈一定的增長趨勢,其中S4的SOD活力始終高于其他4種酵母菌,故選用S4為本實驗酵母菌發酵的菌種。由圖5可以看出,當發酵時間小于24 h時,隨著發酵時間的延長,發酵液中SOD活力顯著增加(p<0.05),在24 h時達到最大值后基本維持不變(p>0.05)。酵母菌發酵過程中會產生乙醇,在0～20 h之間,乙醇含量呈明顯上升趨勢(p<0.05),可能是因為酵母菌的數量隨發酵時間的延長而逐漸增加,致使發酵液中氧氣含量減少,從而導致酵母菌無氧發酵產乙醇的速率增加。由于發酵24 h后發酵液中SOD活力不再增加,所以將酵母菌的發酵時間定為24 h。

圖4 發酵時間對不同菌種SOD活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on SOD activity of different strains注:S1、S2、S3、S4、EDY分別表示安琪酵母1、安琪酵母2、新良酵母、梅山酵母和尤樂博酵母。不同字母為同一時間下不同菌種之間的差異,字母不同表明差異顯著,p<0.05。

圖5 發酵時間對SOD活力和乙醇含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on SOD activity and ethanol content 注:圖中字母不同表示差異顯著,p<0.05；圖6～圖9同。

2.2.2 酵母菌接種量的確定 由圖6可知,隨著酵母菌接種量的增加,發酵液中SOD活力呈先升后降的趨勢,接種量為0.2%時,發酵液中SOD活力顯著高于其他組(p<0.05),說明酵母菌發酵產SOD的最佳接種量為0.2%。乙醇含量隨接種量的增加逐漸降低(p<0.05),可能是由于接種量增加,酵母菌的生長受到發酵液中營養物質的限制,其死亡速率高于生長速率,酵母菌的活菌數逐漸減少,無氧發酵速率降低,最終導致乙醇含量降低。當接種量為0.2%時,SOD活力最高,故確定酵母菌的接種量為0.2%。

圖6 酵母菌接種量對SOD活力和乙醇含量的影響Fig.6 Effect of inoculation quantity on SOD activity and ethanol content

2.2.3 初始pH的確定 由圖7可知,發酵液中SOD活力隨初始pH的增加呈顯著下降趨勢(p<0.05),乙醇含量也隨之降低(p<0.05),可能是較高的pH抑制了酵母菌的生長,使活菌數減少,產酶能力降低,從而導致發酵液中SOD活力和乙醇含量都逐漸降低。當初始pH為5.0時,發酵液中SOD活力達到最大,由于酵母菌發酵結束后要接種乳酸菌,若初始pH太低則不利于后期乳酸菌發酵,所以確定初始pH為5.0。

圖7 初始pH對SOD活力和乙醇含量的影響Fig.7 Effect of initial pH on SOD activity and ethanol content

2.2.4 裝瓶量的確定 由圖8可知,隨著裝瓶量的增加,SOD活力顯著下降(p<0.05),乙醇含量呈上升趨勢(p<0.05),可能是氧氣含量的減少抑制了酵母菌的生長,無氧發酵速率加快,從而導致了SOD活力降低和乙醇含量升高。由此可以看出,溶氧量對酵母菌發酵有較大的影響,增加溶氧量即降低裝瓶量有利于酵母菌產酶,考慮到經濟情況,本實驗將裝瓶量確定為30 mL。

圖8 裝瓶量對SOD活力和乙醇含量的影響Fig.8 Effect of bottling capacity on SOD activity and ethanol content

2.2.5 蛋白胨添加量的確定 由圖9可以看出,隨著蛋白胨添加量的增大,發酵液中SOD活力呈先升后降的趨勢(p<0.05),當添加1.2%的蛋白胨時,發酵液中SOD活力達到最大值。添加一定量的蛋白胨有利于酵母菌生長,從而促進其產酶。當蛋白胨添加量大于1.2%時,可能是因為發酵液中C:N降低,抑制了酵母菌的生長和產SOD,使發酵液中SOD活力降低,乙醇含量增加。綜上可知,蛋白胨添加量為1.2%較合適。

圖9 蛋白胨添加量對SOD活力和乙醇含量的影響Fig.9 Effect of peptone addition on SOD activity and ethanol content

2.3 復合發酵

因為乳酸菌和酵母菌的最適生長溫度和需氧情況相差較大,所以方法a不合適;又經對比實驗發現,按方法b發酵,酵母菌生長明顯不良,應該是乳酸菌利用發酵液中的營養物質的速度比酵母菌快,且過度發酵會使乳酸菌死亡。因此,為獲得高SOD活力和大量乳酸菌活菌,采用方法c,先接種酵母菌發酵產酶,再接種乳酸菌,使其發酵提供活菌并改善風味。

酵母菌發酵24 h結束后,發酵液pH為4.8,此時再接入乳酸菌發酵。由圖10A可知,酵母菌活菌數在0～36 h不斷增大,其數量在36 h時達到最大值后呈下降趨勢,乳酸菌活菌數量逐漸增加。由圖10B可知,SOD活力在24 h時達到最大值后基本維持不變。接入乳酸菌后乙醇含量逐漸下降,有可能是因為乳酸菌發酵產生乳酸和其他物質,促進了乙醇的分解。此外,乙醇是一種親神經性物質,容易轉化成自由基,而SOD是清除自由基的重要酶類[17,18],36 h后酵母菌活菌數減少,其產乙醇的速率隨之降低,此時SOD間接促進乙醇分解的速率大于乙醇產生的速率,所以發酵液中乙醇含量降低。由于本課題組后期會對白首烏酵素的解酒護肝功效進行研究,故乙醇含量越低對后面研究越有利。隨著總發酵時間的延長,乳酸菌活菌數不斷增加,SOD活力保持最大值不變且乙醇含量不斷降低,雖然酵母菌活菌數下降,但其含量依然較高,故確定總發酵時間為60 h,乳酸菌的發酵時間為36 h。

圖10 復合發酵對發酵液的影響Fig.10 Effect of complex fermentation on fermentation broth

3 結論

本實驗對乳酸菌單獨發酵的條件(發酵時間、接種量和菌種復配比例)和酵母菌單獨發酵的條件(菌種、發酵時間、接種量、初始pH、裝瓶量和蛋白胨添加量)分別進行了優化,確定將LA和LP以1∶1 (v∶v)的比例混合作為乳酸菌發酵的菌種,并確定采用先接種酵母菌后接種乳酸菌發酵的方式得到的乳酸菌活菌數和SOD活力較優,在該順序下得到的最佳復合發酵條件為:在初始pH5.0、添加1.2%的蛋白胨和裝瓶量為30 mL(250 mL)的條件下,先接種0.2%的S4,30 ℃下振蕩發酵24 h。酵母菌發酵結束后,再接種3%的復合乳酸菌(LA和LP的比例為1∶1 (v∶v)),37 ℃靜置發酵36 h,最后于4～8 ℃低溫后發酵12 h產香。在此條件下,最終酵素中乳酸菌活菌為2.61×108CFU/mL,酵母菌活菌數為7.9×107CFU/mL,SOD活力為4.23×104U/L。本文首次以純白首烏清汁為發酵基質,采用有益菌發酵的方法研制了一款新型的白首烏產品,該產品含有的大量活菌和功效酶,不僅提高了白首烏產品的附加值,還有利于當地產業的發展。