液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋中的喹諾酮類和四環素類抗生素

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(1.寧夏回族自治區食品檢測中心,寧夏銀川 750002; 2.寧夏回族自治區疾病預防控制中心理化科,寧夏銀川 750004)

喹諾酮類抗生素(Quinolones)是人工合成的廣譜性抗菌藥物,具有高效、低毒等特點,現已廣泛用于畜牧業。由于缺乏科學的理論指導,喹諾酮類抗生素濫用現象十分嚴重,使得生物體產生耐藥性,并且對環境產生污染,從而對人體健康構成威脅[1-2]。四環素類抗生素(Tetracyclines)是一類堿性廣譜抗生素,包括從鏈霉菌屬培養物提取的四環素、土霉素、金霉素,以及半合成的強力霉素等,可對肝臟和腸胃造成損害,還能導致嬰兒先天性耳聾,損害男性生殖系統,造成不孕不育等[1-3]。農業部235公告對雞蛋中喹諾酮類和四環素類抗生素的殘留情況做出明確規定[4],惡喹酸的最大殘留量為50 μg/kg,恩諾沙星為產蛋雞禁用,其余未作規定的喹諾酮類抗生素視為不得檢出;土霉素、金霉素和四環素的最大殘留量為200 μg/kg,強力霉素為產蛋雞禁用。

目前,對食品中喹諾酮類和四環素類抗生素的前處理方法主要是具有反相或混合模式的固相萃取法(SPE)[6-11],該方法具有快速高效等特點,但是由于雞蛋提取液中水溶性蛋白質等雜質較多,在具體操作過程中,往往會出現堵塞篩板、增加操作難度等問題。因此,本文在國家風險監測手冊和相關文獻報道的方法[5-11]基礎上,在固相萃取富集凈化之前,采用934-AH玻璃纖維濾紙對提取液進行過濾,這樣做可有效地去除大部分油脂和蛋白質等雜質,減小了對固相萃取小柱堵塞的影響,凈化過程中可以自然重力過柱,大大提高了工作效率,減小了雜質干擾和基質效應,建立液相色譜-串聯質譜法快速檢測喹諾酮類和四環素類抗生素的方法,以期為寧夏地區雞蛋中四環素類抗生素的殘留分析和確證工作提供參考方法,同時也為提高液質聯用操作能力提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

30份雞蛋 為寧夏省風險監測項目抽檢樣品,采樣過程符合國家標準要求。雞蛋樣品500 g,去殼,置于塑料保鮮盒中,用一次性筷子充分攪拌混勻,準確稱取5.00 g充分混勻的雞蛋樣品于50 mL塑料離心管中,待檢,其余樣品密封保存于-20 ℃冰箱中;甲酸 色譜純,美國ACS;甲醇和乙腈 色譜純,德國Merck;磷酸氫二鈉和檸檬酸等 優級純,上海國藥集團;諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、達氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、土霉素、金霉素、四環素和強力霉素等11種喹諾酮類和4種四環素類抗生素 德國Dr. Ehrenstorfer;氧氟沙星-d8、恩諾沙星-d5、沙拉沙星-d8、惡喹酸-d5和氟甲喹-13C3等5種同位素內標 德國Witega。

LC-20AD UFLC超快速液相色譜儀 日本SHIMADZU;4000 Q-Trap LC-MS/MS 美國AB SCIEX;N-EVAP氮吹儀 美國Organomation;3-30K臺式冷凍離心機 德國Sigma;漩渦混合器 美國IKA;實驗用超純水 均為Milli-Q超純水儀制備;Oasis HLB固相萃取小柱 美國Waters公司,規格:200 mg,6 cc;0.2 μm GD/X Nylon多層針頭式濾器和934-AH玻璃纖維濾紙 美國WHATMAN公司,直徑110 mm,1.5 μm。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑和標準溶液的配制 Mcllvaine緩沖溶液的配制:將1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合,必要時用鹽酸和氫氧化鈉調節pH=4.0±0.5。

0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制:稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1625 mL 0.1 mol/L Mcllvaine緩沖溶液,振搖溶解即得。

喹諾酮類和四環素類抗生素標準溶液的配制:分別稱取喹諾酮類和四環素類抗生素標準物質,用甲醇配制成1.0 mg/mL的標準儲備液。用甲醇稀釋配制成標準中間液(10.0 μg/mL)。用甲醇稀釋配制成標準工作液(1.0 μg/mL)。

同位素內標溶液的配制:分別稱取同位素內標,用甲醇配制成1.0 mg/mL的標準儲備液。用甲醇稀釋配制成標準中間液(10.0 μg/mL)。用甲醇稀釋配制成標準工作液(1.0 μg/mL)。

1.2.2 樣品前處理 取5.00 g雞蛋樣品,加入1.0 μg/mL同位素內標工作液40 μL,再加入0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL,渦旋混勻,超聲提取10 min,4 ℃下12000 r/min離心10 min。雞蛋樣品待凈化液經934-AH玻璃纖維濾膜過濾除去部分水溶性蛋白等雜質,備用。HLB小柱,使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。吸取上述提取液10 mL倒入小柱中(自然重力過柱),待過柱完成后,用6 mL水淋洗,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液于試管中,置于氮吹儀上,50 ℃下吹至近干后,用乙腈-0.1%甲酸水(5/95,V/V)定容至1 mL,渦旋混勻30 s,采用0.2 μm GD/X Nylon多層針頭式濾器過濾到進樣小瓶中,供LC-MS/MS檢測。

1.2.3 抗生素檢測條件

1.2.3.1 喹諾酮類抗生素的色譜條件 色譜柱:Atlantis T3柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣體積:10.0 μL;流動相:A:0.2%甲酸水,B:乙腈;梯度洗脫程序:0.0～0.5 min:10% A;0.5～3.0 min:10%～60% A;3.0～5.0 min:60%～80% A;5.0～6.0 min:80%～100% A;6.0～7.0 min:100% A;7.0～8.0 min,100%～10% A;8.0～10.0 min,10% A。

1.2.3.2 四環素類抗生素的色譜條件 Waters Atlantis T3柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進樣體積:10 μL;流動相:A:0.1%甲酸水,B:乙腈,梯度洗脫程序:0.0～2.5 min:10%～30% A;2.5～5.0 min:30%～90% A;5.0～6.0 min:90%～99% A;6.0～7.0 min:99% A;7.0～9.0 min,99%～10% A;9.0～10.0 min,10% A。

1.2.3.3 質譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描(ESI+);檢測方式:多反應監測(MRM);氣簾氣(CUR):15 psi;電噴霧電壓(IS):5500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣(GS1):40 psi;輔助氣(GS2):40 psi。11種喹諾酮類和四環素類抗生素及5種同位素內標的相關質譜參數見表1。

表1 質譜采集參數Table 1 Mass spectrometry acquisition parameters

1.2.4 色譜和質譜條件的選擇 選擇Waters Atlantis T3柱(2.1×100 mm,3.0 μm)作為分析柱,比較甲醇-水和乙腈-水兩個分離體系的效果。

1.2.5 提取和凈化條件的選擇 比較雞蛋樣品提取液經934-AH玻璃纖維濾紙過濾和未經過濾對SPE的影響。

1.2.6 標準曲線的繪制 準確稱取5.00 g已混勻的基質空白樣品,置于50 mL離心管中,分別精密量取適量標準工作液和同位素內標工作液,按“1.2.2”操作,制備工作曲線溶液。最終的上機濃度為2.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200和500.0 ng/mL,內標濃度均為20.0 ng/mL。氧氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、惡喹酸和氟甲喹等采用同位素內標法定量,以目標組分峰面積與相應內標峰面積的比值Y為縱坐標,以標準工作液的濃度X(ng/mL)為橫坐標,進行線性回歸,繪制工作曲線;諾氟沙星、培氟沙星、環丙沙星、達氟沙星、洛美沙星、二氟沙星,以及土霉素、金霉素、四環素和強力霉素等采用外標法定量,以目標組分峰面積Y為縱坐標,以標準工作液的濃度X(ng/mL)為橫坐標,進行線性回歸,繪制工作曲線。

1.2.7 加標回收率實驗 準確稱取5.00 g已混勻的不含待測物的基質空白樣品,置于50 mL離心管中,分別添加2.0、4.0和20.0 μg/kg 15種藥物進行回收率試驗。加標樣品揮干有機溶劑,4 ℃下避光保存12 h后,按“1.2.2”方法操作,制備基質加標溶液。最終上機濃度為5.0、10.0和50.0 ng/mL,內標濃度均為20.0 ng/mL。

1.2.8 實際樣品的檢測 對寧夏省風險監測項目抽檢的共計30份雞蛋樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件的優化

比較了甲醇-水作和乙腈-水兩個分離體系的效果,結果發現乙腈-水的分離效果較好。為了進一步改善峰形和靈敏度,當流動相中含有0.1%的甲酸時,靈敏度較高,峰形較好。因此,本文采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

選擇在電噴霧正離子模式下測定11種喹諾酮類和四環素類抗生素及5種同位素內標。先在全掃描模式中獲得準分子離子[M+H]+,隨后切換到子離子掃描模式,調節去簇電壓和碰撞電壓,獲得兩個豐度較高、穩定和干擾較小的子離子(見表1)。

2.2 提取和凈化條件的優化

經研究表明,采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液超聲提取,一定程度減小了喹諾酮類和四環素類抗生素與金屬的螯合反應,保證了藥物的游離狀態和在SPE上的良好保留性,但是雞蛋樣品的水溶性蛋白質等雜質較多,即使采用緩沖液沉淀蛋白和高速離心等方法,仍然存在大量的雜質,直接上柱凈化時會堵塞固相萃取小柱,難以自然重力過柱,往往需要給予很大的正壓,增加了前處理過程的難度和時間,而且這樣處理的樣品經檢測后發現有很大的雜質干擾和基質效應,不利于進行定量分析。因此,本文在相關文獻方法[5-9]的基礎上進行了改進,在固相萃取富集凈化之前,采用934-AH玻璃纖維濾紙對提取液進行過濾,這樣做可有效地去除大部分油脂和蛋白質等雜質,減小了對固相萃取小柱堵塞的影響,凈化過程中可以自然重力過柱,大大提高了工作效率,減小了雜質干擾和基質效應。

2.3 工作曲線、相關系數及檢出限

為了消除基質效應對定量結果的影響,本文采用標準加入法制作工作曲線。11種喹諾酮類和4種四環素類抗生素的相關系數(r)、檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)的數據見表2。

表2 11種喹諾酮類和4種四環素類抗生素的線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Regression equations,correlation coefficient,limits of determination and limits of quantification of eleven quinolones and four tetracyclines

2.4 方法的回收率及精密度

結果表明,三個加標水平下喹諾酮類抗生素回收率為80.5%～114.0%,相對標準偏差小于12.0%;四環素類抗生素的平均回收率為84.5%～110.0%,相對標準偏差小于10.0%,滿足雞蛋中11種喹諾酮類和4種四環素類抗生素殘留檢測的要求。

表3 雞蛋中11種喹諾酮類和4 種四環素類抗生素的加標回收率和相對標準偏差Table 3 Recovery of standard addition and the relative standard deviation of quinolones and tetracyclines in egg

續表

2.5 實際樣品的檢測

用本方法對寧夏省風險監測項目抽檢的共計30份雞蛋行了檢測,其中環丙沙星檢出1份(1/30),含量為10.3 μg/kg;氧氟沙星檢出1份(1/30),含量為1.8 μg/kg;氟甲喹檢出1份(1/30),含量為1.2 mg/kg;恩諾沙星檢出3份(3/30),含量為3.6～9.2 μg/kg;惡喹酸檢出1份(1/30),含量為3.3 μg/kg。根據235公告,檢出環丙沙星、氧氟沙星、氟甲喹和恩諾沙星的雞蛋均不符合公告的規定;檢出氟甲喹的雞蛋未超過公告最大殘留量的規定[4]。土霉素檢出11份(11/30),含量為1.0～142.8 μg/kg;金霉素檢出3份(3/30),含量為1.6～10.2 μg/kg;四環素檢出5份(11/30),含量為0.9～1.7 μg/kg;強力霉素檢出12份(12/30),含量為3.4～1600 μg/kg。根據235公告,檢出土霉素、金霉素和四環素的雞蛋均未超過公告最大殘留量的規定;檢出強力霉素的雞蛋不符合公告的規定[4]。雞蛋陽性樣品的提取離子流圖見圖1。

圖1 雞蛋陽性樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of egg positive samples注:a:氧氟沙星;b:環丙沙星;c:恩諾沙星;d:惡喹酸;e:氟甲喹;f:金霉素;g:四環素;h:土霉素;i:強力霉素。

3 結論

本文采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取,玻璃纖維濾膜過濾除雜,HLB固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯質譜直接測定了雞蛋中11種喹諾酮類和4種四環素類抗生素的含量,回收率(80.0%～114.0%)和精密度(<12.0%)符合相關檢測要求。檢出限(S/N=3)為0.2 μg/kg,定量限(S/N=10)為0.8 μg/kg。該方法快速簡便、靈敏度高、重現性好,對于加強寧夏地區該項目的監測工作具有重要意義。