齊墩果酸拮抗赭曲霉毒素A誘導的HEK293T細胞自噬性死亡

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(1.遵義醫科大學公共衛生學院,貴州遵義 563000; 2.貴州省預防醫學實驗教學示范中心,貴州遵義 563000; 3.遵義醫科大學基礎醫學院,貴州遵義 563000)

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是由曲霉菌屬和青霉屬等絲狀真菌產生的低分子量次級代謝產物[1]。飼料[2]和食品中都存在廣泛的OTA污染。報道的OTA污染的食品或食品原料包括谷物及其制品、肉類、雞蛋、乳制品、干制品、蔬菜、水果、葡萄酒、豆類、堅果、香料、嬰幼兒谷物甚至嬰兒配方奶粉[3]。因此,很難完全避免OTA暴露的風險。1993年,OTA被國際癌癥研究機構(IARC)歸類為2B類致癌物(可能的人類致癌物)。雖然OTA沒有像黃曲霉毒素那樣被歸類為1類致癌物(人類致癌物),但這并不意味著OTA毒性明顯低于黃曲霉毒素,只是因為OTA致癌的人類流行病學證據非常稀少,不如黃曲霉毒素對人類致癌的證據充分,所以才歸為2B類致癌物[4-5]。事實上,OTA對嚙齒動物和家禽是強致癌物[6]。OTA的主要靶器官是腎臟[7-8]。OTA誘導的腎毒性機制主要包括:抑制蛋白質合成,干擾轉錄調控，代謝酶、細胞信號和組蛋白修飾[9],阻滯細胞周期,誘導氧化應激和細胞凋亡,激活自噬[10],以及上述機制之間的相互作用[3]。

齊墩果酸(oleanolic acid,OA)是一種生物活性的五環三萜類化合物,廣泛存在于各種食品原料中,如櫻桃、木瓜、葡萄、柿子、藍莓、山楂、大棗和枇杷等。目前的研究表明OA對糖尿病性腎病、多囊腎病、腎纖維化、高血壓性腎損傷、藥物及重金屬誘導的腎損傷等腎損傷均有一定的保護作用[11]。

許多食物或食物成分如番茄紅素、α-生育酚、兒茶素、白藜蘆醇等對OTA的腎毒性都有一定的拮抗作用[3]。但明確有護腎作用的OA對OTA的腎毒性是否同樣有拮抗作用還未見報道,因此本文擬對OA拮抗OTA誘導的HEK293T細胞毒性的機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

齊墩果酸(純度≥97%) 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;赭曲霉毒素A(純度≥97%) 以色列Fermentek公司;人胚腎上皮細胞(HEK293T) 來源于中國農業大學食品科學與營養工程學院;胎牛血清 美國Hyclone公司;DMEM(高糖)培養基 北京索萊寶科技有限公司;丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺 美國Amresco公司;Alpha-Tubulin抗體 武漢三鷹生物技術有限公司;Phospho-p70 S6 kinase(Thr389)抗體、Phospho-mTOR(Ser2448)抗體、Phospho-Beclin-1(Ser15)(D4B7R)抗體和LC3B(D11)XP?抗體 美國細胞信號技術中國分公司;增強型CCK8試劑盒、活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG 上海碧云天生物技術有限公司。

BC-J80S二氧化碳培養箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司;Centrifuge 5418R高速冷凍離心機 艾本德中國有限公司;Navios流式細胞儀 貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司;Mini-PROTEAN?Tetra垂直電泳槽、Chemi DocTMTouch化學發光成像儀 美國伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;TP-114微量電子天平 丹佛儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 HEK293T細胞培養選用DMEM完全培養基,內含10%胎牛血清,1%三抗(三種抗生素包括青霉素、鏈霉素和兩性霉素B的混合物),1%非必需氨基酸,2% L-谷氨酰胺和86% DMEM(高糖)培養基。用0.001%多聚L-賴氨酸鋪板37 ℃孵育15 min后按2.5×104個HEK293T細胞/cm2接種,在37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養24 h。

1.2.2 OA處理對細胞存活率的影響檢測 將1.2.1得到的細胞按1萬個細胞/孔接種于96孔板中,每孔約80%表面長滿HEK293T細胞時,給予7個不同濃度的OA(0、1、4、8、12、20和40 μmol/L)處理2 h,處理結束后重新換上100 μL DMEM培養基,然后每孔加入10 μL增強型CCK8溶液,在培養箱內37 ℃繼續孵育2 h,450 nm波長下檢測吸光度值并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(處理組OD值-空白組OD值)×100/(對照組OD值-空白組OD值)?？瞻捉M不接種細胞,但加入等量DMEM培養基和CCK8溶液的對照組。每組處理做5個復孔的重復[1]。通過細胞存活率的檢測確定OA進一步實驗的處理濃度。

1.2.3 OA和OTA處理對細胞存活率的影響檢測 將1.2.1得到的細胞按1萬個細胞/孔接種于96孔板中,每孔約80%表面長滿HEK293T細胞時,分6組(對照組、OTA組、OA組、P組、M組和L組)進行給藥。其中對照組僅加100 μL DMEM培養基;OTA組僅加OTA處理;OA組僅加OA處理;P組為先OA處理,處理結束后用OTA處理;M組為OTA處理22 h后,用OA和OTA同時處理2 h;L組為先OTA處理,處理結束后用OA處理。每組的OTA和OA各自的處理時間和濃度如下:OTA處理HEK293T細胞的時間為24 h,OA處理HEK293T細胞的時間為2 h;OTA處理濃度為實驗室之前已經實驗確定好的半數抑制濃度8 μmol/L[12],OA處理濃度由1.2.2的細胞存活率實驗確定。給藥結束后重新換上100 μL DMEM培養基,然后每孔加入10 μL增強型CCK8溶液,在培養箱內37 ℃繼續孵育2 h,450 nm波長下檢測吸光度值并按1.2.2方法計算細胞存活率。

1.2.4 OA和OTA處理對活性氧簇(ROS)含量的影響檢測 將1.2.1得到的細胞接種于6孔板中,每孔約80%表面長滿HEK293T細胞時,按1.2.3分組進行處理,處理結束后吸干處理液用PBS緩沖液漂洗1次。用無血清DMEM培養基將DCFH-DA熒光探針稀釋1000倍,終濃度為10 μmol/L,按照每孔1 mL加入稀釋好的DCFH-DA熒光探針37 ℃孵育20 min,用無血清DMEM培養基洗滌3次,去除未進入細胞內的DCFH-DA熒光探針。以Rosup為活性氧陽性對照試劑,同樣處理獲得活性氧陽性細胞。將各組細胞制成單細胞混懸液放入流式管中,用流式細胞儀檢測活性氧水平水平。每組處理做3個復孔的重復[1]。

1.2.5 OA和OTA處理對自噬相關蛋白表達的影響檢測 按照比例(裂解液∶PMSF∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制)(100∶1∶2∶2)配制好裂解液后置于冰上待用。細胞按1.2.3分組處理結束后用預冷PBS緩沖液漂洗3次,吸干后每個培養皿加入200 μL裂解液,用細胞刮刀刮下貼壁細胞,轉移到預冷的EP管中,冰上靜止30 min,12000 r/min、4 ℃離心30 min,吸取上清液得到蛋白樣本。之后按照以下步驟操作:80～120 V進行蛋白電泳,以180 mA恒定電流電轉90 min后取出PVDF膜用5%封閉液室溫封閉1～2 h,一抗(Alpha-Tubulin、Phospho-p70 S6 kinase、Phospho-mTOR、Phospho-Beclin-1、LC3B)4 ℃孵育過夜,TBST洗膜后室溫下二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG)孵育1～2 h,洗膜后顯色,用化學發光成像儀獲取圖像,并在軟件中獲得蛋白條帶的灰度值[1]。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 OA處理對細胞存活率的影響

如圖1所示,與對照組相比,低濃度的OA(1 μmol/L)能夠顯著提高細胞存活率(p<0.05),有一定的促增殖作用。隨著OA處理濃度的增加細胞存活率稍有降低,但與對照均無顯著差異(p>0.05),說明OA確實是一個生物活性成分,即使在較高濃度(40 μmol/L)下也沒有明顯的毒性。因此,選用具有生物活性的低濃度OA(1 μmol/L)作為進一步實驗的濃度。

圖1 不同濃度OA對細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of OA on cell viability注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05),下圖同。

2.2 OA和OTA處理對細胞存活率的影響

如圖2所示,與對照組相比,OA處理顯著增加細胞存活率(p<0.05),OTA處理顯著降低細胞存活率(p<0.05)。與OTA組相比,P組(OA預處理組)、M組(OA與OTA同時處理組)和L組(OA后處理組)細胞存活率均顯著提升(p<0.05),提示實際生活中無論哪種方式攝入含OA的食品在一定程度上能夠對OTA誘導的腎細胞毒性有一定的拮抗作用。

圖2 OA和OTA處理對細胞存活率的影響Fig.2 Effect of OA and OTA treatment on cell viability

2.3 OA和OTA處理對ROS含量的影響

如圖3所示,與對照組相比,OTA處理組顯著增加了細胞內活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)含量(p<0.05),OA處理組ROS含量略有升高,但與對照組無顯著差異(p>0.05)。與OTA組相比,P組和L組ROS含量顯著降低(p<0.05),M組有降低ROS含量的趨勢,但與OTA處理組ROS含量差異不顯著(p>0.05),比P組和L組降ROS的效果稍差一點。但P組、M組和L組這3組之間的ROS含量無顯著差異(p>0.05),且與對照組無顯著差異(p>0.05),這提示實際生活中無論哪種方式攝入含OA的食品在一定程度上能夠對OTA誘導的ROS升高有一定的拮抗作用。

圖3 OA和OTA處理對ROS水平的影響Fig.3 Effect of OA and OTA treatment on ROS contents

2.4 OA和OTA處理對自噬相關蛋白表達的影響

如圖4所示,與對照組相比,OTA組磷酸化的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)和磷酸化的p70S6激酶(p-p70s6k)的表達顯著降低、磷酸化的Beclin1(p-Beclin1)和LC3-II的表達顯著增加(p<0.05),OA組p-mTOR、p-p70s6k、p-Beclin1和LC3-II的表達無明顯差異(p>0.05)。與OTA組比較,L組p-mTOR和p-p70s6k表達顯著增加、p-Beclin1和LC3-II的表達顯著降低(p<0.05),M組p-Beclin1和LC3-II的表達顯著降低(p<0.05),P組p-Beclin1的表達顯著降低(p<0.05)。mTOR通過磷酸化來抑制ULK1復合物來抑制自噬。p70S6K作為mTOR磷酸化激活的下游蛋白,p70S6K(Thr389)的表達狀況也可部分反映mTOR活性。ULK1通過磷酸化Beclin1激活PI3KC3復合物1形成吞噬泡,進而招募LC3-I共價到磷脂酰乙醇胺上轉變成LC3-II定位到吞噬泡膜上形成自噬體激活自噬,因此可以用LC3-II/LC3-I的水平來反映自噬激活情況[14]。因此,雖然1 μmol/L OA不會明顯激活或者抑制自噬,但是能不同程度緩解OTA誘導的HEK293T細胞自噬,L組最為顯著。

圖4 OA和OTA處理對自噬相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of OA and OTA treatment on the expression of autophagy-related proteins

3 討論

ROS作為一個細胞內信號分子參與了自噬的調節及自噬性細胞死亡,同時也受到自噬的調節[15-16]。有研究表明ROS與mTOR和自噬之間存在一定的聯系。例如,Xu等[17]報道的毛酸漿(茄科植物)提取物通過誘導ROS產生來抑制mTOR從而誘導自噬。本實驗研究表明不同OA處理方式能夠不同程度的緩解OTA誘導的ROS的升高,尤其是L組(圖3),而L組對自噬的抑制也最為明顯(圖4),這與Xu等[17]所證實的結論相一致。

自噬是一個自我吞噬的體系,將包括細胞器在內的一些細胞組分包裹進一個叫做自噬體的雙層膜結構,然后與溶酶體融合,被溶酶體內的水解酶降解[18]。胞內外應激、饑餓信號、生長因子剝奪、內質網應激、致病菌感染及損傷的細胞器或蛋白質聚集積累等都會誘導自噬來維持細胞在不利環境中的生存,此時自噬作為一種細胞生存的保護機制,當發生過度自噬時,細胞發生自噬性細胞死亡[19]。自噬不足或者過度都會導致細胞損傷,恰當的調節自噬對細胞健康是必要的。自噬被上游信號級聯網絡嚴格控制,其中mTOR已被確定為自噬的關鍵負調節因子[20]。圖4觀察到OTA通過下調p-mTOR、p-p70S6K的表達,上調p-Beclin1、LC3-II的表達來誘導自噬。結合圖2來看,OTA激活了自噬但是并沒有導致細胞存活率增加,反而導致了更多細胞的死亡,這就說明OTA誘導的自噬屬于過度自噬,引起的細胞的自噬性死亡。因此,結合圖2～圖4可以說明,雖然1 μmol/L OA不會明顯誘導ROS產生和激活自噬,但是能夠通過調節p-mTOR、p-p70S6K、p-Beclin1和LC3的表達來不同程度緩解OTA誘導的HEK293T細胞的自噬性死亡,L組最為顯著。所以,人們通過攝入含OA的食品或多或少都能夠對OTA誘導的腎細胞毒性有一定的拮抗作用。

4 結論

1 μmol/L OA不會明顯誘導ROS產生和激活自噬(p>0.05),但是能夠通過調節p-mTOR、p-p70S6K、p-Beclin1和LC3的表達來不同程度緩解OTA誘導的HEK293T細胞的自噬性死亡,OA后處理方式效果最為明顯(p<0.05)。所以,人們通過攝入含OA的食品能夠對OTA誘導的腎細胞毒性有一定的拮抗作用。