非標記定量蛋白質組方法分析鱘魚肽抗D-半乳糖導致的小鼠衰老作用的研究

,,, ,*,,*

(1.大連醫科大學附屬第二醫院臨床營養科,遼寧大連 116023; 2.大連大學附屬中山醫院 麻醉二科,遼寧大連 116001; 3.大連海洋大學食品科學與工程學院,遼寧大連 116023)

鱘魚類為一類軟骨硬鱗魚,具有極高的經濟價值。中國現有鱘魚類為2科3屬8種,分布于長江水系、黑龍江水系以及新疆[1]。鱘魚不僅有豐富的營養,還擁有重要的藥用價值。據《本草拾遺》記載[2]:“鱘魚,肉味甘,性平,無毒。補虛益氣,令人肥健?！?。研究表明,鱘魚含有豐富的不飽和脂肪酸、硫酸軟骨素、蛋白質、礦物質元素等[3]。這些物質往往具有多種多樣的生理活性。因此,鱘魚具有潛在的抗氧化、抗衰老、抗疲勞作用。尋找鱘魚的潛在藥用活性部位,是利用好鱘魚資源的關鍵之一。研究發現,鱘魚頭的軟骨中含有大量的硫酸軟骨素,因此鱘魚頭也成為硫酸軟骨素新的來源。鱘魚頭經過酶解等加工過程,可以獲得肽類、多糖類等具有利用價值的化合物,不但可以獲得鱘魚藥用部位的研究結果,而且可以極大地提高鱘魚產業的經濟效益。

衰老是機體各組織器官在多種原因、多種生理反應作用下發生的結果。在提出的許多衰老原因中,免疫功能下降學說和自由基學說具有一定的地位[4]。近年來,開發具有抗衰老作用的多肽類物質成為熱點。樊金娟等[5]研究了經中性蛋白酶酶解米糠所獲得的米糠抗氧化肽的抗衰老作用,先利用D-半乳糖致衰小鼠構建模型,再灌胃米糠抗氧化肽,結果表明,米糠抗氧化肽組與衰老組相比,高劑量(500 mg/kg bw)米糠抗氧化肽可顯著提高致衰老小鼠心腦線粒體過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和總三磷酸腺苷酶(T-ATPase)活性(p<0.05),明顯降低小鼠腦線粒體DNA(mtDNA)缺失突變水平(p<0.01),效果優于中、低劑量米糠抗氧化肽組,米糠抗氧化肽具有較好的抗衰老作用。吉雅等[6]研究了大豆短肽顆粒劑對衰老小鼠模型的作用,發現大豆短肽可以顯著降低衰老小鼠血清和肝組織中的丙二醛(MDA)含量,并顯著升高其超氧化物歧化酶(SOD)活力,而且大豆短肽還可以顯著提高小鼠的免疫功能,促進其脾細胞增殖,因此大豆短肽顆粒劑有顯著的抗衰老和增強免疫的作用。曹新志[7]研究了富含谷胱甘肽制品對小鼠抗衰老能力的影響,發現飼喂富含谷胱甘肽制品的小白鼠顯著提高了其抗衰老能力。李琳等[8]利用D-乳糖致衰小鼠模型灌胃鳙魚肽,發現其可使致衰小鼠肝腦組織中MDA的含量明顯下降,腦組織中單胺氧化酶(MAO-B)的活性顯著降低(p<0.01),抗氧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物酶的活性有所提高,并能使致衰小鼠吞噬細胞的吞噬能力顯著提高(p<0.01)。

鱘魚養殖目前成為水產養殖的一個熱點。養殖鱘魚的主要目的是為了獲得鱘魚卵,它是高級魚子醬的重要原料。鱘魚頭是鱘魚加工的主要副產物,目前鱘魚頭并沒有得到很好的利用,主要是因為鱘魚肽(Acipenser schrenki Brandt peptides,ASP)的生物活性沒有很好的研究。本論文對從鱘魚副產物制備的ASP的性質進行研究,進而利用D-半乳糖致衰老小鼠模型以及非標記定量蛋白質組學技術研究鱘魚肽的抗衰老作用,以期從分子水平上闡述鱘魚肽抗衰老機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱘魚肽(Acipenser schrenki Brandt peptides,ASP) 分子量介于805～3300 Da,長陽清江鵬博開發有限公司(湖北武漢);SPF級雄性昆明小鼠(體重18～22 g) 大連醫科大學實驗動物中心[SCXK(遼)2008-0002];總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白質測定試劑盒 南京建成生物工程公司;D-半乳糖、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、吲哚乙酸(IAA) Bio-Rad公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、NH4HCO3、三氟乙酸(TFA)、C18Cartridge Sigma公司;BCA定量試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;胰蛋白酶(Trypsin) Promega公司;10 kDa超濾離心管 Sartorius公司;小鼠-3多重親和去除液相色譜柱(Multiple Affinity Removal LC Column-Mouse 3)、上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18)、分析柱(Thermo scientific EASY column,10 cm,ID75 μm,3 μm,C18-A2) Agilent公司;其它試劑 為國產分析純。

5430R低溫高速離心機、真空離心濃縮儀 Eppendordf公司;Triple TOF 6600+質譜儀 AB SCIEX公司;Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 D-半乳糖致小鼠衰老模型的建立、給藥和處理

將60只SPF級昆明小鼠(雄性)稱重后隨機分為5組,分別為正常組、衰老模型組、鱘魚肽低、中、高濃度劑量組,其中除正常組每天注射等體積生理鹽水外,其他各組每天都皮下組織注射0.5 mL 5% D-半乳糖(生理鹽水配制)。低、中、高濃度劑量組每日分別灌胃一次低濃度100 mg/(kg·d)、中濃度200 mg/(kg·d)、高濃度400 mg/(kg·d)鱘魚肽水溶液,正常組和衰老模型組給予生理鹽水(0.1 mL/20 g),連續灌胃6周后,稱重,摘眼球取血,離心(3000 r/min 10 min),取上層血清,-20 ℃冰箱凍存備用。處死小鼠后迅速取其肝臟和大腦,生理鹽水洗凈,用濾紙吸干血水,各組織稱取0.3 g,制成10%勻漿液,離心(4500 r/min 10 min),取上清液,4 ℃備用。

1.3 小鼠體質量及組織臟器指數測定

小鼠在電子天平上稱重后處死,快速取出肝臟、腦、胸腺和脾,生理鹽水洗凈,用濾紙吸干血水,直接在電子天平上稱重,臟器指數=臟器質量(mg)/小鼠體質量(g)。

1.4 生化指標測定

按試劑盒說明測定小鼠血清中T-AOC能力、SOD活性和MDA含量。

1.5 蛋白質組樣品制備

取D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清和鱘魚肽灌胃中、高劑量組等比例混合小鼠血清各50 μL,均采用去血清高豐度親和色譜柱,按照Agilent對應方案[9-11]中的操作方法獲得小鼠血清中低豐度蛋白組分。經超濾濃縮后加入等體積SDT裂解液,沸水浴裂解小鼠血清中低豐度蛋白15 min,再于14000×g條件下離心20 min。上清采用BCA法進行定量。鱘魚肽灌胃小鼠血清低豐度蛋白質樣品標記為Z,D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清低豐度蛋白質樣品標記為M。

1.6 SDS-PAGE電泳

取未經去血清高豐度親和色譜柱處理的模型組小鼠血清蛋白(Ori)、D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清低豐度蛋白質的3個平行樣本(分別標記為M1、M2、M3)和鱘魚肽灌胃小鼠血清低豐度蛋白質的3個平行給藥綜合組樣品(分別標記為Z1、Z2、Z3)各20 μg,按5∶1(體積比)加入5倍上樣緩沖液,沸水浴5 min,進行12.5% SDS-PAGE電泳。條件:恒流15 mA,電泳時間60 min,考馬斯亮藍染色。

1.7 樣品酶解

分別取各組蛋白質樣品30 μL,加入0.003 mmol DTT,沸水浴5 min后冷卻至室溫。加入200 μL尿素緩沖液(8 mol/L尿素,150 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)混勻后,在10 kDa超濾離心管中于14000×g離心15 min,棄濾液(重復該步驟一次:加尿素緩沖液,混勻,超濾),加入100 μL 100 mmol/L IAA緩沖液(以尿素緩沖液溶解),在600 r/min條件下振蕩1 min,室溫避光30 min后于14000×g離心15 min,加入100 μL尿素緩沖液,于14000×g離心15 min(該步驟重復兩次:加IAA緩沖液、振蕩、避光、離心、加尿素緩沖液、離心),加入100 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液,于14000×g離心15 min兩次,加入40 μL 0.1 g/L胰蛋白酶緩沖液(以100 mmol/L NH4HCO3溶液配制),600 r/min振蕩反應1 min,37 ℃靜置16 h。換新收集管,于14000×g離心15 min,再加入40 μL 25 mmol/L NH4HCO3,于14000×g離心15 min并收集濾液。通過C18Cartridge脫鹽凍干后,以40 μL 0.1%甲酸溶液復溶,測定280 nm吸光值。

1.8 酶解產物的LC-MS/MS鑒定

酶解后的樣品,采用納升流速的HPLC液相系統Easy nLC進行分離。A相:0.1%甲酸水溶液,B相:0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以300 nL/min 95%的A相平衡,樣品依次通過上樣柱和分析柱分離。0～50 min,B相線性梯度0%～35%;50～55 min,B相線性梯度35%～100%;55～60 min,B相維持100%。經色譜分離后的樣品用Q-Exactive質譜儀進行質譜分析。

1.9 MaxQuant的數據分析

質譜分析原始數據為RAW文件,采用MaxQuant軟件(版本號1.3.0.5)[12-13]進行查庫鑒定,并根據Label free算法進行定量分析[14-15]。

1.10 基因本體(Gene Ontology,GO)功能注釋

利用Blast2GO[16]對目標蛋白質集合進行GO注釋。利用NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe)比對小鼠血清數據庫,保留E值≤0.001的前10條,再依次通過提取、注釋。

1.11 KEGG通路注釋及其注釋的富集分析

利用KEGG Automatic Annotation Server軟件[17]獲取目標蛋白質序列參與的通路信息。通過Fisher精確檢驗評價GO term或KEGG通路蛋白質富集度的顯著性水平。

1.12 數據處理

2 結果與分析

2.1 衰老模型組動物一般情況

衰老模型組的小鼠連續6周皮下組織注射5% D-半乳糖0.5 mL/d(生理鹽水配制)后,小鼠毛色變灰暗,失去光澤,形體瘦弱,行動緩慢以及精神萎靡不振,體質量僅增加18.02 g,增加量明顯低于正常級(表1),呈現出明顯衰老體征,表明建模成功。

表1 對小鼠體質情況及臟器指數的影響Table 1 Effects of ASP on body weight and its organs index of mice

2.2 治療組小鼠體質變化情況及臟器指數

各組SPF級雄性昆明小鼠灌胃對應溶液6周后,進行體重變化及臟器指數統計(表1),結果表明,各組小鼠體重均有所增加,但增加量各不相同。正常組小鼠體質量增加21.83 g,鱘魚肽低、高劑量組體重增加量分別為17.22、18.07 g,與正常組相比具有顯著差異(p<0.05),中劑量組增加量為20.04 g,與正常組相比無顯著性差異(p>0.05)。D-半乳糖致小鼠衰老時,致使小鼠代謝紊亂,進而導致體重增加緩慢[18]。

在臟器指數中,各給藥組的肝指數和胸腺指數與正常組相比不顯著(p>0.05),但中、高劑量組的脾指數與正常組相比,增加顯著(p<0.05),低劑量組的脾指數增加不顯著(p>0.05);中劑量組的腦指數低于正常組,變化顯著(p<0.05),且與模型組相比,差異極顯著(p<0.01),而低、高劑量組的腦指數與正常組相比,差異不顯著(p>0.05)。脾臟是重要的免疫器官,灌胃鱘魚肽后,可以增加脾臟指數,可在一定程度上增強小鼠機體免疫功能。

2.3 生化指標檢測

對小鼠血清中T-AOC、SOD活性和MDA含量進行測定,結果見表2。由表2可見,與模型組相比,灌胃鱘魚肽中、高劑量組極顯著升高了小鼠血清中T-AOC和SOD活性(p<0.01)。灌胃鱘魚肽低、中、高劑量組均能極顯著降低MDA含量(p<0.01)。注射D-半乳糖后,小鼠體內T-AOC下降,SOD活性降低,MDA含量升高,從而引起小鼠衰老現象發生,灌胃鱘魚肽后,小鼠體內T-AOC增加,因此,鱘魚肽具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。

表2 小鼠血清中T-AOC、SOD活性和MDA含量Table 2 T-AOC,SOD activity and MDA content in serum in mice

2.4 血清樣品SDS-PAGE和質譜測定

SDS-PAGE(見圖1A)結果表明,未經去血清高豐度親和色譜柱處理的模型組小鼠血清蛋白(Ori)中66 kDa附近蛋白含量過高,影響低豐度蛋白分析,而D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清低豐度蛋白質的3個平行樣本M1、M2、M3和鱘魚肽灌胃小鼠血清低豐度蛋白質的3個平行給藥綜合組樣品Z1、Z2、Z3電泳條帶清晰,且各平行組內樣品平行性良好,可以進行質譜驗證樣品平行性。質譜分析Basepeak結果見圖1B和圖1C,從Basepeak圖譜可以看出,組間樣本平行性好,表明酶解效果良好,適合進行非標記定量質譜測定。

圖1 小鼠血清樣本平行性Fig.1 Samples parallelism of proteins in serum in mice注:A:小鼠血清蛋白SDS-PAGE; B:去除高豐度蛋白的模型組M1小鼠血清蛋白質譜圖; C:去除高豐度蛋白的給藥綜合組Z1小鼠血清蛋白質譜圖。

2.5 蛋白質鑒定結果統計

通過Maxquant中的Label free算法對二級質譜數據進行非標記定量計算結果如表3,3個模型組鑒定到肽段數分別為3101、3352、3328個,查庫分別得到295、312、321種蛋白質;3個灌胃鱘魚肽組鑒定到肽段數分別為3335、3299、3320個,查庫分別得到321、308、317種蛋白質。

表3 蛋白質鑒定結果統計Table 3 Statistic of identified proteins

通過GO功能注釋,結果如圖2。小鼠低豐度蛋白參與了21個生理過程,其中蛋白質數目較多的是單生物過程、代謝過程、細胞過程;具有7種分子功能,主要是具有結合和催化活性功能;存在于10種細胞組分中,主要在細胞部分、細胞、細胞器和細胞膜外區中。

圖2 基因本體2水平統計Fig.2 GO level 2 statistics

對參與的生物學過程、具有的分子功能和所處的細胞組分對小鼠血清低豐度表達蛋白質進行分類,通過Fisher精確檢驗評價小鼠血清低豐度表達蛋白質顯著富集度(表4)。結果表明,在小鼠血清低豐度表達蛋白質中,與M組相比,Z組有4、2和2種顯著表達的蛋白質分別參與了糖代謝過程、活性氧響應和細胞氧化還原3個生物過程,其富集度分別為0.19、0.4和0.33;而參與信息素結合、小分子結合、氣味結合、轉運、異構化、糖苷鍵水解和糖化合物水解等7個生物功能的蛋白質分別有3、5、3、4、2、2、2種表達顯著。

表4 顯著富集的GO term統計Table 4 Enriched GO terms

在模型組的3個平行組和在灌胃鱘魚肽的3個平行組中,篩選出同一平行組中至少有兩個非空值的數據,同時根據蛋白質表達差異倍數>2.0倍(上調或下調)且p值<0.05的篩選標準,獲得差異表達蛋白質3個,其中1個上調,2個下調(表5),即二磷酸甘油酸變位酶表達量顯著上調(Z/M為2.07,p<0.05),間α胰蛋白酶抑制劑H4和主要尿蛋白20表達量顯著下調(Z/M分別為0.38和0.22,p<0.05)。根據蛋白質表達差異倍數>1.5且p值<0.05的篩選標準,獲得9個蛋白質(5個上調,4個下調)進行生物信息分析(表5),其中5種表達上調的蛋白質為二磷酸甘油變位酶、載脂蛋白D、黃素還原酶、纖蛋白-1和過氧化物酶-2,4種表達下調的蛋白質分別為巰基氧化酶1、主要尿蛋白1、間α胰蛋白酶抑制劑H4和主要尿蛋白20。這9種蛋白質中,二磷酸甘油酸變位酶、黃素還原酶和過氧化物酶-2分別參與糖酵解途徑、卟啉和葉綠素代謝途徑、細胞凋亡途徑。二磷酸甘油酸變位酶、載脂蛋白D、黃素還原酶和過氧化物酶-2的上調以及巰基氧化酶1的下調可以提高機體清除自由基的能力。

表5 進行生物信息學分析的9種蛋白質Table 5 Statistic of the 9 proteins for bioinformatics analysis

生物體內的各種蛋白質在行使其生物功能時,常常需要其他相關蛋白質參與。將這些相互作用的蛋白質以網絡形式連接,從而獲得蛋白質交互作用網絡。灌胃鱘魚肽小鼠差異表達蛋白質的交互作用網絡見圖3。從圖中可以看出,主要尿蛋白1(AC:Q4FZE8,基因名Mup1)、間α胰蛋白酶抑制劑H4(AC:A6X935,基因名Itih4)、二磷酸甘油酸變位酶(AC:P15327,基因名Bpgm)、黃素還原酶(AC:Q923D2,基因名Blvrb)、過氧化物酶-2(AC:Q61171,基因名Prdx2)、纖蛋白-1(AC:Q08879,基因名Fbln1)分別與4、4、1、2、9和1種蛋白具有交互作用。

圖3 差異表達蛋白質相互作用網絡Fig.3 PPI networks of the 9 proteins

3 結論

本研究通過D-半乳糖致小鼠衰老實驗,發現鱘魚肽可以引起小鼠體重、脾指數、血清中T-AOD和SOD活力增加,并同時降低MDA含量。去除高豐度蛋白后的小鼠血清樣本中,鱘魚肽可以導致小鼠血清中二磷酸甘油酸變位酶、載脂蛋白D、黃素還原酶和過氧化物酶-2的表達上調,并導致巰基氧化酶1表達量下調,這些蛋白質表達量的增加或降低,可以提高機體清除自由基的能力,延緩小鼠衰老過程。這些結果表明,分子量為805～3300的鱘魚肽具有抗小鼠衰老作用。