hTWEAK基因重組慢病毒載體構建、病毒包裝及蛋白表達分析

許媛，趙明才

(1.川北醫學院附屬醫院檢驗科；2.川北醫學院醫學檢驗系；3.川北醫學院轉化醫學研究中心，四川 南充 637000；4.遂寧市中心醫院檢驗科，四川 遂寧 629000)

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見的惡性腫瘤，每年全球約有100萬人患HCC[1-2]，其中約50%發生在中國[3-4]。腫瘤壞死因子樣微弱凋亡誘導劑(TNF-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)是腫瘤壞死因子配體超家族的成員之一。TWEAK由249個氨基酸組成，經蛋白酶處理后成為含156個氨基酸的可溶性細胞因子，與細胞腫瘤壞死因子受體超家族成員Fn14結合發揮生物學效應。TWEAK/Fn14信號通路在調節腫瘤細胞細胞增殖、存活、侵襲及血管生成等生物學過程中具有重要的作用[5-6]。因此，調節TWEAK表達可能成為腫瘤治療的新策略。本研究通過分子克隆技術構建攜帶TWEAK基因的慢病毒載體，并通過PCR、間接免疫熒光和Western Blot技術對TWEAK進行表達分析，為探討TWEAK在肝癌發生發展中的生物學功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人胚腎細胞293T(購自美國ATCC)，人肝癌細胞系HepG2(川北醫學院轉化醫學研究中心保存)。

1.2 載體及主要試劑

慢病毒包裝質粒(pMD2.G、pCMV-VSV-G、pRSV-Rev)及慢病毒載體質粒(Plentilox3.7)均由川北醫學院轉化醫學研究中心郭曉蘭教授惠贈；大腸桿菌DH5α由川北醫學院轉化醫學研究中心保存；基礎培養基DMEM購自Hyclone公司、胎牛血清FBS和胰酶(0.25%，含EDTA)購自Gibco公司、青霉素(10 000 U/mL)和鏈霉素(10 000 μg/mL)購自華北制藥公司；質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自Gibco公司；qRT-PCR mix 購自TaKaRa公司；限制性內切酶(NheⅠ和BsrGⅠ)、T4 DNA連接酶、DNA maker購自Fermentas公司； Lipofectamine TM 2000、Trizol 購自美國Invitrogen公司；酵母提取物及胰蛋白胨購自Oxioid公司。

1.3 TWEAK基因擴增

PCR擴增人TWEAK基因序列：根據TWEAK基因CDS區(GenBank:AF030099.1，GI:2707219，1 306 bp)及酶切位點設計引物(表1)，以質粒pORF5-hTWEAK為模板進行擴增。反應條件如下：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，62 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35 cycles；72 ℃ 10 min。擴增完成后采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物大小。

表1 人TWEAK基因擴增引物序列

1.4 Plentilox3.7-TWEAK重組質粒的構建、轉化、篩選和鑒定

將擴增的hTWEAK基因片段及載體質粒Plentilox3.7在37 ℃條件下用限制性內切酶NheⅠ和BsrGⅠ進行雙酶切，2 h后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳。切下含目的片段的凝膠，按照膠回收試劑盒提供的方法回收目的片段。在T4 DNA連接酶作用下將目的基因連接至Plentilox3.7載體中。將連接產物轉化入感受態細胞DH5α并進行培養和篩選，挑取單個菌落、增菌、提取質粒，將提好的質粒用NheⅠ和BsrGⅠ酶進行雙酶切并通過PCR進行鑒定。取測序正確的克隆進行增菌，用除內毒素大提試劑盒大量提取陽性重組質粒。

1.5 慢病毒包裝

復蘇293T細胞，傳代培養。消化對數生長期的細胞，計數，按5×106/盤的量接種于10 cm細胞培養皿中，在37 ℃、5% CO2培養箱內培養細胞至70%～80%融合度時更換無血清培養基，繼續培養2 h后進行脂質體轉染。利用脂質體Lipofectamin2000TM將含hTWEAK的質粒和包裝質粒(pMD2.G、pCMV-VSV-G、pRSV-Rev)共轉染293T細胞(包裝含hTWEAK基因的病毒，實驗組)，同時將不含hTWEAK的質粒和上述三種包裝質粒共轉染293T細胞(包裝不含hTWEAK基因的病毒，對照組)。在37 ℃、5% CO2培養箱內培養6 h后更換為完全培養基，72 h后收集培養上清液即為過表達hTWEAK的病毒液以及無hTWEAK的陰性對照病毒液。將收集的上清液在4 ℃、3 000 g離心力條件下離心10 min后收集上清液。用0.45 μm濾器過濾離心后的上清，無菌分裝后保存于-80 ℃冰箱備用。

1.6 重組病毒感染目的細胞

將對數生長期的HepG2細胞鋪入24孔板中，培養過夜，使細胞融合度達到50%左右。從-80 ℃冰箱取出病毒液冰上融化，分別按照1∶10和1∶100的比例配制病毒懸液和完全培養基的混合液，加入10 μg/mL的Polybrene以提高感染率，同時設置陰性對照組。在37 ℃、5% CO2條件下繼續培養48 h后，更換新鮮培養基繼續培養至72 h。

1.7 qRT-PCR檢測HepG2細胞中TWEAK基因相對表達量

從培養箱取出24孔板，收集上清后采用0.25%胰酶消化細胞，3 500 rpm/min離心5 min收集細胞，加入1 mLTrizol試劑混勻，按照說明書提取細胞總RNA，采用NanoDrop 2 000 c微量分光光度計測量RNA濃度。采用逆轉錄試劑盒以RNA為模板逆轉錄成cDNA后，采用SYBR Green染料法檢測實驗組和對照組中TWEAK mRNA相對表達量。

1.8 免疫熒光法檢測HepG2細胞中TWEAK表達

取出24孔板，去上清后用PBS洗滌2次。采用多聚甲醛(4%)固定細胞15 min后，用TBST洗滌3次，再將含0.1% Triton X-100和5% BSA的封閉液加入培養皿中封閉，1 h后棄去封閉液，滴加1∶100稀釋的兔抗人TWEAK工作液，4 ℃ 孵育過夜。棄去工作液后再用PBS洗滌3次，滴加1∶64稀釋的FITC標記的山羊抗兔工作液，37 ℃孵育30 min。孵育結束后用PBS洗滌3次，滴加DAPI工作液(1∶1 000稀釋)室溫孵育5 min，PBS洗滌3次后在熒光顯微鏡下觀察。

1.9 Western Blot檢測HepG2細胞中TWEAK表達

從培養箱取出24孔板，收集上清備用。收集細胞，在冰上裂解細胞30 min后 4 ℃離心收集蛋白。采用BCA法測量總蛋白濃度后，Western Blot檢測HepG2細胞中TWEAK蛋白表達量。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 hTWEAK的PCR擴增產物

采用普通PCR技術從pORF5-TWEAK質粒中擴增TWEAK基因序列全長片段，其產物大小為750 bp。

2.2 重組質粒Plentilxo3.7-TWEAK鑒定

2.2.1 PCR及酶切鑒定 hTWEAK基因與載體質粒Plentilxo3.7重組，構建Plentilxo3.7-TWEAK重組質粒。以Plentilxo3.7-TWEAK重組質粒為模板，PCR擴增TWEAK基因片段，瓊脂糖凝膠電泳后可見一條750 bp的特異性條帶；對Plentilxo3.7-TWEAK重組質粒用NheⅠ和BsrGⅠ酶進行雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳可見一條750 bp條帶和7 670 bp左右的條帶(圖1)。

2.2.2 測序鑒定 挑取含Plentilxo3.7-TWEAK重組質粒的陽性克隆，擴大培養，提取質粒后送南京金斯瑞公司基因測序(圖2)，將測序結果與NCBI-blast數據庫進行比對分析，重組質粒堿基序列正確，無突變位點。

2.3 細胞轉染結果

2.3.1 實時熒光定量PCR檢測結果 如圖3所示，Plentilxo3.7-TWEAK轉染組TWEAK mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)。

2.3.2 免疫熒光檢測結果 免疫熒光檢測TWEAK蛋白表達及定位，其中綠色熒光信號代表TWEAK蛋白。由此可見，Plentilxo3.7-TWEAK重組質粒能在HepG2細胞中表達，且主要分布在胞漿中(圖4)。

2.3.3 Western-blot檢測結果 如圖5所示，轉染Plentilxo3.7-TWEAK重組質粒的HepG2細胞中，TWEAK蛋白表達水平明顯高于對照組。

3 討論

TWEAK基因作為腫瘤壞死因子配體超家族中的重要成員，在肝臟疾病發生發展中具有重要的作用。TWEAK能通過NF-κB介導的肌球蛋白輕鏈激活和破壞緊密連接的方式促進丙肝病毒進入肝細胞[7]，也能驅動肝祖細胞和肝星狀細胞之間通過細胞因子和化學因子“交叉對話”而影響慢性肝損傷病理結果[8]。TWEAK也能促進肝癌細胞增殖，在肝癌細胞系SMMC7721中通過siRNA沉默TWEAK基因后，肝癌細胞的增殖和遷移能力均受到抑制[9]。TWAEK除具有促腫瘤效應外，它同時也具有抗腫瘤效應。TWAEK可通過JAK-STAT信號通路誘導大腸癌WiDr細胞產生β-干擾素，從而發揮抗腫瘤效應，γ-干擾素可增加TWAEK誘導的細胞死亡[10]。這些研究提示，TWEAK在肝臟疾病的發生和發展過程中具有重要的作用，調節TWEAK表達可望成為疾病治療的重要途徑。

肝細胞肝癌發病隱蔽，不易早期發現，因此傳統的手術切除治療、放射治療和藥物治療是肝癌治療的主要手段。隨著分子生物學技術的發展，腫瘤基因治療逐漸成為腫瘤最具前景的治療方式之一。腫瘤基因治療需要載體運送基因序列或基因干擾序列。慢病毒載體是基因治療中常用的病毒載體。慢病毒載體是改造的人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)載體，具有感染效率高、自身抗原性弱、表達穩定、操控性強、可容納外源目的基因片段大、可感染分裂期和非分裂期細胞等優點，已經被廣泛地應用于生命科學和醫學研究。本研究成功構建了攜帶人TWEAK基因的慢病毒載體質粒，并能在293T細胞中成功包裝出具有活性的慢病毒顆粒。將含有TWEAK基因的慢病毒顆粒感染HepG2細胞后，其TWEAK基因mRNA及蛋白表達水平明顯高于不攜帶TWEAK基因的慢病毒感染的細胞。間接免疫熒光技術發現外源性TWEAK蛋白表達主要位于細胞質，證明TWEAK基因成功轉入肝癌細胞中并合成了目的蛋白。這些結果提示，本研究所構建的攜帶TWEAK基因的慢病毒載體能在HepG2細胞中高效表達TWEAK，這為研究TWEAK對肝癌細胞生物學行為的影響及分子機制奠定了基礎。