宣威女性肺腺癌及腦轉移瘤組織中Notch1的表達及臨床意義研究

牛華濤，白鵬，左頻，袁紅平，陳穎，黃云超

(1.昆明醫科大學第三附屬醫院·云南省腫瘤醫院神經外科，云南省肺癌研究重點實驗室，云南 昆明 650118；2.昆明醫科大學第一附屬醫院微創神經外科，云南 昆明 650032；3.昆明醫科大學第三附屬醫院·云南省腫瘤醫院胸外科，云南省肺癌研究重點實驗室，云南 昆明 650118)

作為新發病例數量和死亡率都居體內各種腫瘤第一位的肺癌[1-2]，愈后差，且近年來發病率仍有不斷上升趨勢[3]。肺癌易發生遠處轉移，而腦是其常見的轉移器官之一[4]。肺癌患者發生腦轉移的概率高約23%至65%，屬于顱內各種轉移瘤最常見的原發腫瘤類型[1]。據統計，肺癌導致的腦轉移瘤病例超過腦內原發性腫瘤的10倍，已經在腦內各種惡性腫瘤中排名第一[5]。

肺癌腦轉移患者僅有約1個月的自然中位生存期，而即使經過治療后的此類患者，中位生存時間也僅可延長到3.1～12個月[6]。因此，對于肺癌發生腦轉移的患者而言，如何有效延長生存期具有重大的現實意義，進一步研究肺癌如何發生腦轉移的機制已經受到更多的關注。

中國云南宣威地區的女性肺癌是全球肺癌發病率及死亡率均為最高的非吸煙女性肺癌[7]，細胞類型以腺癌為主，具有發病年齡提前、放化療不敏感的特征?？祁}組之前已經進行了相關研究，結果顯示，Notch信號通路與宣威女性肺腺癌的發生發展密切相關，Notch1在宣威女性肺癌中呈高表達，表現為促癌作用[8-9]，而在進一步的更加深入研究過程中，目前Notch1在肺癌腦轉移瘤中的表達及相關性研究尚不清楚，值得深入研究。

課題組假設Notch1可能在宣威女性肺腺癌患者發生腦轉移的過程中起到部分作用，擬通過對宣威女性肺腺癌原發灶和腦轉移灶中的Notch1表達差異進行初步研究，初步了解其在肺癌發生腦轉移過程中的部分作用，為后續更加深入的研究奠定部分基礎。

1 資料和方法

1.1 臨床研究資料

納入標準：(1)各項臨床資料完整無缺失；(2)在宣威地區出生并生活居住超過3代；(3)女性原發性肺腺癌患者；(4)無吸煙史。排除標準：(1)曾行放、化療；(2)患有其他類型腫瘤。

1.2 資料來源

20位患者來源于2003年1月至2013年12月在云南省腫瘤醫院和昆明醫科大學第一附屬醫院先后行肺癌及腦轉移瘤的切除手術，術后均行病理學檢測，而且病理學檢測結果均為腺癌。年齡方面：其中14例患者超過55歲，6例患者<55歲；病理方面：高分化腺癌1例，中分化腺癌4例，低分化腺癌15例；肺癌原發灶方面：最大直徑≤3 cm者7例，最大直徑﹥3 cm者13例；腦轉移瘤方面：腫瘤最大直徑≤3 cm者5例，腫瘤最大直徑﹥3 cm者15例。各有20例的原發灶及腦轉移灶組織標本，切除后的腫瘤標本均于1 h內放置于4%多聚甲醛中固定備用。樣本采集均得到患者及家屬的同意，并事先報備并取得云南省腫瘤醫院和昆明醫科大學第一附屬醫院倫理委員會同意。

1.3 方法

免疫組織化學染色：常規石蠟包埋，連續切片，制備病理切片，采用免疫組織化學SP法。步驟按試劑盒說明書操作。Notch1一抗為兔抗人多克隆抗體(美國Millipore公司，1∶100)，陰性對照為PBS代替一抗。按半定量積分法判定蛋白表達結果，見表1。

表1 按半定量積分法判定蛋白表達結果

*陰性、弱陽性表達歸類為低表達；中等、強陽性表達歸類為高表達。

1.4 統計學分析

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，P<0.05為統計學意義差異。肺癌原發灶及腦轉移灶間的Notch1蛋白的表達關系采用χ2檢驗。

2 結果

Notch1蛋白的陽性染色呈棕黃色顆粒，細胞質為主要定位區域，在宣威女性肺腺癌原發灶組織中呈65%的陽性表達率；而在腦轉移灶中呈85%的陽性表達率，兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、圖2及表2。

表2 Notch1在宣威女性肺腺癌原發灶及腦轉移灶組織中的表達

標本Notch1蛋白表達陽性陰性χ2值P值原發灶137腦轉移灶17311.60.009

3 討論

統計資料表明，腦內各種轉移瘤的數量已經超過原發性顱內腫瘤的10倍，上升為腦內所有惡性腫瘤的首位[5]。對于肺癌患者而言，最終大約有23%～65%的患者最終會發生顱內轉移。

肺癌的發病率一般有如下表現：男性患者超過女性患者，城市患者高于農村患者，而且來自發達地區的患者高于來自落后地區的患者。而來自云南省宣威地區的肺癌患者發病率卻與其他地方表現不一致，有著自己的獨特特征：農村患者高于城市患者、女性患者所占比明顯高于其他地區[3]。

中國云南宣威地區的女性肺癌是全球范圍內發病率及死亡率都為最高的非吸煙女性肺癌[7]，細胞類型以腺癌為主。以前將宣威女性肺癌的主要致病因素歸為室內燒煤污染?？墒?，經過當地的改爐改灶工作后，調查發現：源自宣威地區的肺癌患者(尤其是女性肺癌患者)死亡率并未得到下降；相反，仍有上升[7]。鑒于此結果，對于宣威女性肺癌的高發致病因素而言，除去外在的環境因素，機體內在的遺傳基因因素亦逐漸受到更多的重視和關注。

肺癌若進展到腦轉移階段，預后極差。據統計，此類患者若脫離治療，其僅有約1個月的中位生存時間；而即使是經過各種放化療、靶向治療等各種治療后，肺癌腦轉移的患者也僅有3.1～12個月的中位生存時間[6]。

因此，如何有效降低肺癌發生腦轉移的概率、盡量延長此類患者的生存時間具有重要的臨床和現實意義，需要進一步深入了解肺癌如何發生腦轉移的具體機制。

近些年來，由于Notch信號通路在多種腫瘤發生發展中的重要作用，而逐漸受到更多的關注，成為研究熱點。Notch基因可根據腫瘤細胞類型的不同和生長環境的差異而扮演不同甚至相反的角色[10-13]，可能起到抑癌或促癌的角色。

為了探討Notch1在宣威女性肺腺癌發生腦轉移過程中的角色和作用，本課題組之前已經進行了相關研究，結果顯示，Notch1在宣威女性肺癌中呈高表達，表現為促癌作用[8-9]，初步確定了研究的意義和可行性。

基因在轉錄為有功能的蛋白質的過程中，需要經過許多步驟的不同修飾，因此，在本次研究中，為了能更準確的確定Notch1基因在肺癌發生腦轉移過程中的作用，本研究以Notch1蛋白表達來進行研究分析。而且由于在前期在多種腫瘤的研究中Notch1都有異常表達，但結果不夠統一，缺乏經典的陽性對照物。因此，課題組在前期實驗準備中，歷經多次反復嘗試，對抗體濃度、洗滌的要求(例如時間及次數)等進行了進一步優化，結果獲得了可靠的結果，因此，本研究未再選用其他陽性對照物。

本次實驗結果如下：在宣威女性肺腺癌原發灶和轉移灶中分別呈65%和85%的陽性表達率，兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。結果說明，在宣威女性肺腺癌發生腦轉移的過程中，Notch1可能起到部分促癌作用，但具體的相關機制有待進一步深入研究。

綜上，本研究揭示了Notch1與宣威女性肺腺癌發生腦轉移有關，可作為宣威女性肺腺癌及其腦轉移瘤的一個潛在治療靶點，為宣威女性肺腺癌及其腦轉移瘤的治療提供部分實驗依據及可行方向。