一株生防真菌TRCC27001的鑒定及其抑菌特性

于地美, 黃華毅,2, 梁小文, 李肖宇, 田呈明

(1.北京林業大學林學院省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室，北京 100083；2.廣東省林業科學研究院， 廣東 廣州 510520；3.江西天人生態股份有限公司，江西 吉安 343100)

由植物病原真菌引起的一系列植物病害對農業和林業的發展具有較大影響，會造成較大的生態危害和經濟損失.化學藥劑對植物病害的防效高且見效快，是防治各種植物病害的主要手段；但長期使用化學藥劑會導致環境污染、病原菌抗藥性增強、成本升高以及農藥殘留等問題[1].因此，發展環保且高效的替代防治方法逐漸成為植物病害研究的重要方向之一.

生防微生物在植物病害防治中表現出良好的防控效果以及生態安全性，具有較大的開發應用潛力[2].用于防治植物病害的生防微生物種類很多，最常見的為真菌類、放線菌類和細菌類[3].其中，真菌中的哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、綠色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningii)、叢枝菌根(Arbuscularmycorrhiza)、粘帚霉(Gliocladiumspp.)等已在生產中廣泛應用[4-5].木霉菌是全球研究和應用最多的生防真菌之一，有100多種含木霉菌的生物制劑在多個國家得到廣泛使用[6].

目前，對于生防真菌的鑒定主要依靠形態學觀察和基因序列分析.常見的用于真菌分子鑒定的序列有ITS、Tef 1-α、cal等[7].對木霉的鑒定以多基因結合的方式為主，常用ITS序列和Tef 1-α基因結合進行分子生物學分析.本研究將對菌株TRCC27001進行鑒定，并測定其對多種常見林業、農業病原真菌的抑制能力和篩選其最佳發酵培養基，以期為該菌株在植物病害生物防治中的實際應用提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 生防真菌TRCC27001，由江西天人生態股份有限公司提供.植物病原真菌包括立枯絲核菌(Rhizoctorziasolani)、金黃殼囊孢(Cytosporachrysosperma)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、楊樹炭疽菌(Colletotrichumpopuli)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、毛霉(Mucorsp.)、犁頭霉菌(Absidiasp.)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、黑腐皮殼菌(Cytosporaambiens)、細極鏈格孢(Alternariatenuissima)，均由中國林業微生物菌種保藏管理中心提供.

1.1.2 供試培養基 PDA培養基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，瓊脂粉17 g)，PDB培養基為不加瓊脂粉的PDA培養基，膠霉毒素培養基(葡萄糖25 g，酒石酸銨2 g，FeSO40.01 g，MgSO4·7H2O 1 g，蒸餾水1 000 mL)，麥芽浸膏培養基(麥芽浸膏30 g，大豆蛋白胨3 g，無水葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL)，察氏培養基(蔗糖30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 000 mL)，YEMEA 1(酵母膏10 g，麥芽膏10 g，葡萄糖4 g，蒸餾水1 000 mL)，麩皮培養基[麩皮36 g，(NH4)2HPO410 g，K2HPO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g， 蒸餾水1 000 mL]，燕麥培養基[(燕麥片20 g，微量元素溶液1 mL(FeSO4·7H2O 1 g·L-1, MnCl2·4H2O 1 g·L-1, ZnSO4·7H2O 0.1 g·L-1)，蒸餾水1 000 mL]，CMD培養基(玉米粉30 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL).

1.2 生防菌TRCC27001對多種植物病原真菌拮抗效果的測定

通過平皿對峙法[8]檢測生防菌TRCC27001對多種植物病原真菌的拮抗效果.在直徑90 mm的PDA平板上距中心3 cm的相對位置處，分別接種直徑6 mm的病原菌和生防菌菌餅，每個處理重復3次，倒置于25 ℃恒溫培養箱中培養.以病原菌的單獨培養作為對照，每24 h觀測菌落縱橫半徑.計算培養96 h后菌株TRCC27001對病原菌絲生長的抑制率，以及生防菌株與病原菌之間的相對抑制率[9].

菌落生長抑制率/%=(病原菌對照組菌落半徑-對峙培養病原菌落指向生防真菌的半徑)/病原菌對照組菌落半徑×100；

生防菌被抑制率/%=(生防真菌對照組菌落半徑-對峙培養生防真菌指向病原菌落的半徑)/生防真菌對照組菌落半徑×100；

相對抑菌率=菌落生長抑制率/生防菌被抑制率.

1.3 生防菌TRCC27001最佳發酵培養基的篩選

1.3.1 生防菌的發酵培養 生防菌株TRCC27001的發酵培養基為培養絲狀真菌及木霉屬菌株的7種常見培養基.其中，制作燕麥片培養基時需先將燕麥60 ℃水浴1 h，再用4層紗布過濾.發酵培養的具體方法：取生防菌TRCC27001的新鮮菌絲塊(6 mm)5塊，接入裝有100 mL發酵培養基的三角瓶(500 mL)中，25 ℃、150 r·min-1振蕩培養10 d；將發酵培養液于10 000 r·min-1、4 ℃條件下離心,取上清液，用孔徑0.45 μm的濾膜過濾除菌，得到無菌發酵液.

1.3.2 生防菌無菌發酵液的抑菌活性檢測 將TRCC27001無菌發酵液與加熱冷卻至40～50 ℃的PDA以1∶10(v/v)的比例混合，倒平板，在平板中央分別接入新鮮的金黃殼囊孢菌餅(6 mm)，25 ℃倒置培養，每隔一天采用十字交叉法測量病原菌落直徑，直至對照組菌落即將長滿平皿為止.以不加TRCC27001無菌發酵液的平板作為對照，每個處理設3個重復，計算相對抑菌率[10].

相對抑菌率/%=(對照組擴展直徑-處理組擴展直徑)/對照組擴展直徑×100.

1.4 生防菌TRCC27001無菌發酵液的活性穩定性分析

以金黃殼囊孢為指示菌，分別測定采用麩皮發酵培養基培養后的菌株TRCC27001無菌發酵液在不同酸堿度、溫度及輻射時間下的抑菌活性.供試的生防菌無菌發酵液制備后于4 ℃保存備用.每個處理均設3次重復，以未經處理的發酵液混合培養基培養金黃殼囊孢作為對照組，計算相對抑菌率.

相對抑菌率/%=(未混合無菌發酵液組的培養菌落擴展直徑-處理組菌落擴展直徑)/(未混合無菌發酵液組的培養菌落擴展直徑-對照組菌落擴展直徑)×100.

1.4.1 不同pH處理下的穩定性 取適量生防菌無菌發酵液，用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH分別將其調成不同pH值，4 ℃放置30 min，再將各樣品的pH值調回中性后，檢測各處理無菌發酵液的抑菌活性.以不經酸、堿處理的原樣品為對照.

1.4.2 不同溫度處理下的穩定性 取適量生防菌無菌發酵液分別于5、15、25、35、45、55、65、75、85、95、105 ℃條件下處理30 min.以4 ℃放置的無菌發酵液為對照，檢測各處理無菌發酵液的抑菌活性[11].

1.4.3 不同輻射時間下的穩定性 將適量無菌發酵液倒入無蓋的培養皿中，用磁力攪拌器緩慢攪拌，并置于30 W的紫外燈下分別照射0.5、1.0、1.5、2.0 h后，檢測各處理無菌發酵液的抑菌活性.對照組為未經紫外線輻射的原樣品[12].

1.5 生防菌TRCC27001的鑒定

1.5.1 形態學鑒定 采用Jaklitsch[13]的觀測指標，結合孫瑞艷等[14]的描述方式對菌株TRCC27001的形態進行鑒定.

1.5.2 分子生物學鑒定 將生防菌TRCC27001用液體培養基培養后，用CTAB提取法提取其基因組DNA.利用通用引物對ITS1/ITS4擴增ITS片段，ITS1序列為5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4序列為5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[15].采用Tef 1-α擴增引物EF1T(5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′)(SEQ ID NO.3)、EF2T(5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′)(SEQ ID NO.4)進行PCR擴增，獲得Tef 1-α基因序列[16].PCR擴增反應體系：10×PCR buffer(10 mmol·L-1Tris/HCl pH 8.0, 50 mmol·L-1KCl, 1.5～2.0 mmol·L-1MgCl2)，dNTP mix 4 μL，上、下游引物各10 pmol，Taq聚合酶0.5 μL，DNA模板2 μL，加ddH2O至50 μL.PCR擴增循環條件：94 ℃加熱3 min使模板DNA 變性；然后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共進行35個循環；最后在72 ℃延伸5 min，4 ℃保溫.PCR產物經2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在波長365和254 nm的紫外光下檢測為明顯單一條帶的產物，由擎科生物技術有限公司純化后用ABI3700進行雙向直通測序.測得的原始序列采用Bioedit 7.0.9編輯后得到準確序列，經BLAST進行序列比對，得到相似度較高的菌株種類，并與GenBank上的菌株序列組成序列矩陣，再使用最大簡約(maximum parsimony,MP)法構建系統發育樹.

1.6 數據統計與分析

采用Excel 2010和SPSS 20.0軟件對試驗數據進行統計分析，對不同處理組間的結果進行單因素方差分析，應用Duncan氏新復極差法檢驗差異顯著性.

2 結果與分析

2.1 生防菌TRCC27001對多種植物病原真菌的拮抗效果

生防菌TRCC27001對12種常見植物病害的病原真菌均有一定的拮抗效果.培養24 h時，菌株TRCC27001對金黃殼囊孢、禾谷鐮刀菌、毛霉、楊樹炭疽菌、細極鏈格孢沒有抑菌效果，24 h后抑菌率逐漸上升；對葡萄座腔菌、黑腐皮殼菌、立枯絲核菌、犁頭霉菌、尖孢鐮刀菌以及大麗輪枝菌等病原菌在培養24 h時即表現出一定抑菌效果，之后抑菌效果逐漸增強直至相對穩定.培養96 h時，生防菌TRCC27001對各病原真菌的生長抑制率和相對抑菌率如表1所示.此時，生防菌落與12種病原真菌菌落均相接，當生防菌與病原菌完全接觸后，繼續向病原菌方向生長，包圍和覆蓋部分病原菌落；病原菌落被包圍后停止生長，且出現萎縮現象.對峙培養168 h時，在與大麗輪枝菌、葡萄座腔菌、黑腐皮殼菌、立枯絲核菌以及毛霉的對峙平板上，生防菌落已布滿平皿；在與金黃殼囊孢、禾谷鐮刀菌、楊樹炭疽菌、膠孢炭疽菌、犁頭霉菌、尖孢鐮刀菌以及細極鏈格孢的對峙平板上，生防菌落占據大半個平皿，病原菌落周圍萎縮，部分平皿上出現明顯的抑菌帶和菌絲消解痕跡.平皿上生防菌氣生菌絲發達，形成大量的綠色分生孢子堆(圖1)，對峙作用基本停止.這表明生防菌TRCC27001競爭系數高，在與病原菌的對峙培養中，能迅速占領生態位，抑制病原菌生長.

表1 培養96 h時菌株TRCC27001對12種病原真菌的抑制效果1)Table 1 Inhibition effects of strain TRCC27001 on 12 pathogenic fungi after 96 h

1)數據為平均值±標準差.同列數據后附不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

左側平皿為對照組；右側平皿為TRCC27001與病原真菌的對峙培養，其中平皿左側為病原菌，右側為生防菌TRCC27001.圖1 培養168 h時菌株TRCC27001與12種病原真菌的平皿對峙效果Fig.1 Dual-culture effects between strain TRCC27001 and 12 pathogenic fungi after 168 h

2.2 生防菌TRCC27001最佳發酵培養基的篩選

利用麩皮培養基進行發酵培養后，TRCC27001的無菌發酵液對金黃殼囊孢的抑菌能力最強(圖2)，相對抑菌率達79.40%；經膠霉毒素培養基發酵培養獲得的無菌發酵液的抑菌能力最小，相對抑菌率僅為29.79%(圖3).

2.3 生防菌TRCC27001無菌發酵液的活性穩定性

菌株TRCC27001無菌發酵液分別經過0.5、1.0、1.5和2.0 h的紫外線輻射后，仍對金黃殼囊孢保持良好的抑菌活性(圖4A)，指示菌的菌落直徑保持在23 mm內；菌株TRCC27001的無菌發酵液經過不同溫度處理30 min或在強酸和強堿條件下也均能保持良好的抑菌活性(圖4B、4C).這說明菌株TRCC27001的無菌發酵液具有很強的抗逆性.

A.對照組；B.處理組.圖2 經麩皮培養基發酵培養的TRCC27001無菌濾液對金黃殼囊孢的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of TRCC27001 sterile fermentation broth cultured on wheat bran medium against Cytospora chrysosperma

柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05).圖3 發酵培養基對TRCC27001無菌發酵液抑菌能力的影響Fig.3 Influences of fermentation mediums on the inhibitory activity of TRCC27001 sterile fermentation broth

圖4 輻射時間(A)、溫度(B)和pH(C)對無菌發酵液抑菌活性的影響Fig.4 Effects of UV-irradiation time (A), temperature (B) and pH (C) on the inhibitory activity of sterile fermentation broth

2.4 生防菌TRCC27001的鑒定

形態學觀察結果表明，純化的生防真菌TRCC27001菌落在PDA平板上為圓形，生長初期菌絲為白色，氣生菌絲少，25 ℃下培養48～72 h后，產生不定型棉絮狀白色氣生菌絲，分生孢子梗形成小皰，后期氣生菌絲呈現同心輪紋狀(圖5A).生防真菌菌落在CMD平板上為圓形，生長初期菌絲與PDA平板上狀態相似，幾乎無氣生菌絲，25 ℃下培養48 h后，開始形成分生孢子，后期出現明顯的分生孢子堆，匯合成寬的灰綠色同心輪紋(圖5B、5C).PDA平板上菌落背面開始時無色，后期呈暗黃色.顯微鏡下觀察，菌絲無色纖細，具分隔，多分枝；分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，一般具有2～3個輪生的分枝，瓶梗安瓿形，單生或對生，輪枝狀排列(圖5D).大多數分生孢子為卵圓形或亞球形，壁光滑(圖5E、5F).

以菌株TRCC27001基因組DNA為模板，用ITS序列通用引物擴增出一條長度為616 bp的序列，并用Tef 1-α序列通用引物擴增出一條長度為865 bp的序列(GenBank登錄號：KX810817).ITS序列與已知種TrichodermavirensGv29-8的同源性高達99%，Tef 1-α序列與菌株Gv29-8的同源性高達98%.系統進化樹(圖6)表明，菌株TRCC27001與T.virens聚成一類，且遺傳距離最短，結合其生物學特性以及形態學特征，最終將菌株TRCC27001鑒定為綠木霉(T.virens).

A.PDA平板上的菌落形態；B.CMD平板上的菌落形態；C.CMD平板上的分生孢子堆形態；D.CMD平板上的分生孢子梗和層生瓶梗；E、F.分生孢子.圖5 TRCC27001的形態特征Fig.5 Morphological characteristics of strain TRCC27001

圖6 基于ITS序列和Tef 1-α序列以最大簡約法構建的木霉屬系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of Trichoderma constructed by MP method based on combined ITS and Tef 1-α sequences

3 討論

目前，隨著楊樹栽植面積的不斷擴大，由金黃殼囊孢引起的楊樹腐爛病日益嚴重.發病重災區常有林木成片死亡的現象，嚴重制約了林木產業的發展[17].已有研究證明，Psuedomonasfluorcells、Bacillussubtilis、B.punilus、T.viride等均對金黃殼囊孢具有顯著拮抗效果[18].其中，木霉屬(Trichodermaspp.)真菌是常見的土壤習居菌，存在于植物殘體及動物糞便上，現已鑒定的種類超過100種.木霉菌的種群中有一大類被稱為拮抗木霉[19-20]，至少對18屬29種病原真菌表現拮抗活性[21-22].本研究中，菌株TRCC27001對12種常見病原真菌具有較強抑制效果，除楊樹炭疽菌外，相對抑菌率均在1以上.結合ITS序列和Tef 1-α序列進行分析，并根據已報道的木霉屬真菌的形態特征[13,23]，確定該菌株為綠木霉(Trichodermavirens).

木霉菌可以產生多達幾百種的揮發性和非揮發性抗菌次生代謝產物[6,24]，從而抑制甚至殺死病原菌[25].目前已知的抗菌次生代謝產物包括木霉素、膠霉毒素、綠木霉素、抗菌肽以及以非核糖體肽合成酶合成的Peptaibols等[26].菌株在不同的營養環境中會產生不同的有效抗菌物質[27]，且培養基中纖維素的含量會影響抑菌物質的產生.本研究表明，以纖維素含量豐富的麩皮培養基發酵培養的TRCC27001無菌發酵液，對金黃殼囊孢的抑菌活性最強，培養10 d后，病原菌絲生長致密，菌落邊緣增厚.麩皮為小麥加工的副產品，極常見且易獲取，培養基制作成本較低，適合大量發酵使用.另外，檢測生防木霉及其菌劑對高溫、干燥、紫外輻射的抗逆能力以及耐貯性，是其能否進行商業化應用的重要評判標準[28].研究發現，菌株TRCC27001無菌發酵液具有良好的穩定性，在pH 2～12、溫度5～105 ℃的條件下均能保持較強的抑菌活性，且對紫外線輻射不敏感.

綜上所述，菌株TRCC27001的抑菌能力強，抗逆性好，具有較大的開發應用潛力.目前，菌株TRCC27001的其他特性尚不清楚，且其無菌發酵液中有效抑菌物質的種類及其抑菌機制也不明確，有待進一步探索.