野生水鳥感染霍亂弧菌和沙門菌等病原菌的分離和鑒定

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野生動物被認為是“病原的天然儲存庫”，許多烈性的人類傳染病如SARS和埃博拉等，其感染和傳播的源頭都指向野生動物。近些年來，遷徙鳥類傳播禽流感的風險也引起全社會的廣泛關注[1-2]。實際上，遷徙的野生鳥類還可能攜帶和傳播各類主要經腸道感染的病原細菌[3]，一方面可能對水源環境和水產養殖造成污染，另外也可能直接或間接的導致人類感染疾病[4]，由此產生的生物安全和公共衛生問題也值得關注。但是，野生鳥類感染和傳播人獸共患病原細菌的報道，特別是來自國內的報道非常少。2017年8月，內蒙古自治區某濕地自然保護區內發現大量的野生鳥類死亡，本單位采集部分死亡鳥類的組織標本，分離和初步鑒定出霍亂弧菌和沙門菌等多種腸道感染相關的病原菌，本研究可為遷徙野生鳥類攜帶人獸共患病原菌的科學和疾病防控研究提供參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器設備 細菌鑒定使用美國BD公司Phoenix100型全自動微生物鑒定儀，其它為細菌學試驗用常規儀器。

1.1.2菌株 都柏林沙門菌參考菌株和O1型霍亂弧菌分離株為本室保存的菌株。

1.1.3培養基及試劑 細菌培養基和厭氧產氣包購自青島海博生物公司；Trizol試劑為Invitrogen公司產品；PrimeScriptTMRT reagent Kit、PCR Master Mix和DNA Maker等為TaKaRa公司產品；引物合成和測序由吉林省庫美生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1標本采集和運輸 采集的死亡鳥類推斷死亡時間均在1 d以內，個體保存完整，觀察體表無明顯的潰爛和傷口；解剖觀察各臟器沒有明顯的出血和壞死病灶，僅腸道有充血或輕微出血的病變。無菌采集心、肝、脾和肺等組織標本，并剪取一段病變部位的腸段，放在無菌采樣管中，然后放入采樣箱中加冰袋運送到實驗室。

1.2.2細菌分離培養 組織標本在腦心浸液瓊脂和胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸(TSC)瓊脂平板上劃線接種，分別在需氧和厭氧的條件下培養。

1.2.3細菌鑒定 需氧分離培養的典型單菌落首先進行革蘭氏染色、鏡檢觀察，然后選擇對應的細菌鑒定卡使用Phoenix100微生物鑒定儀進行鑒定；厭氧分離培養的細菌挑取黑色的單菌落；所有獲得的菌株同時使用通用引物測定16s rRNA序列，利用GenBank數據庫進行BLAST比對，鑒定細菌種屬。

1.2.4細菌毒力基因的PCR鑒定 霍亂弧菌和沙門菌相關毒力基因的PCR鑒定引物如表1所示，參考相關文獻合成[5-10]。產氣莢膜梭菌參考相關文獻[11]合成4種主要毒素基因(α、β、ε和ι毒素)的鑒定引物，基于PCR鑒定的結果確定毒素型。

1.2.5病毒核酸檢測 組織標本勻漿后使用Trizol試劑提取總RNA，參照國家標準《禽流感病毒RT-PCR檢測方法 NY/T 772-2013》和《新城疫診斷技術 GB/T 16550-2008》規定的RT-PCR方法檢測禽流感和新城疫病毒的核酸。

表1 霍亂弧菌和沙門菌PCR鑒定引物Tab.1 Primers used for identification of Vibrio cholerae and Salmonella sp.

2 結 果

2.1細菌分離鑒定結果 共采集4只死亡野鳥的病料組織標本，細菌分離鑒定的結果如表2所示。其中有1只死亡的赤頸潛鴨在本研究培養條件下未分離到任何的病原細菌，有2只野鳥(鸕鶿和骨頂雞)分離到霍亂弧菌，2只野鳥(紅嘴鷗和骨頂雞)分離到沙門菌，其它分離到的致病菌和條件致病菌還包括產氣莢膜梭菌、溫和氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌等。

表2 野鳥的病料組織標本細菌分離鑒定結果Tab.2 Isolation and identification of pathogenetic bacteria from diseased tissue of wild birds

2.2產氣莢膜梭菌毒素分型結果 經PCR鑒定，所有分離菌株僅α毒素基因鑒定為陽性，其它3種毒素鑒定均為陰性，說明本次分離的產氣莢膜梭菌均為毒素A型。

2.3霍亂弧菌毒力基因的鑒定結果 PCR鑒定的結果如表3所示，本次分離的菌株檢測霍亂弧菌特異性膜蛋白ompW和溶血素hlyA基因為陽性，而檢測O1和O139血清群的特異性rfb基因以及霍亂毒素ctxA基因、霍亂毒素相關的菌毛和ChxA毒素基因均為陰性。說明本次分離的霍亂弧菌不屬于O1和O139血清群，也不攜帶霍亂毒素。

表3 霍亂弧菌毒力基因的PCR鑒定結果Tab.3 PCR result of Vibrio cholerae virulence genes

2.4沙門菌毒力基因的鑒定結果 經PCR鑒定，本次分離的菌株檢測沙門菌侵襲基因invA和四氫葉酸還原酶結構蛋白基因ttrBCA均為陽性，檢測sefA菌毛基因為陰性，而都柏林沙門菌參考菌株檢測3種基因均為陽性。

2.5病毒核酸檢測結果 經RT-PCR鑒定，所有標本檢測禽流感和新城疫病毒的核酸均為陰性。

3 討 論

從本次死亡野鳥的病料標本中分離到多種的病原細菌，其中類志賀鄰單胞菌和溫和氣單胞菌等是人或動物臨床常見的條件致病菌和繼發感染的細菌；產氣莢膜梭菌也是環境和動物腸道內的常在菌，在特殊條件下可能異常的聚積、增殖并產生毒素，導致動物急性發病死亡[12]，也可能導致人類的食物中毒性疾病。而在傳統意義上，霍亂弧菌和沙門菌都是能夠引起原發性腸道感染的病原菌。

霍亂弧菌較多分布在河流入?？诘扔幸欢}度的水生態環境中[6-7]，其O1和O139血清群攜帶霍亂毒素，能夠激活腸上皮細胞的腺苷酸環化酶，引起cl-離子的分泌和Na+離子的吸收障礙，水伴隨著離子進入腸腔，引起嚴重的水樣腹瀉。而其它非O1/O139血清群菌株也可能攜帶其它的毒力因子，導致腹瀉或者其它的感染疾病。例如，近些年新鑒定的cholix毒素(ChxA)[13]，是一種真核細胞延伸因子2(eEF2)特異的ADP核糖基轉移酶，可阻止細胞的蛋白合成，表現強烈的細胞毒性。本次分離的菌株非O1/O139血清群，沒有霍亂毒素和cholix毒素，可能并非高致病性的菌株。但是這些低致病性的菌株分布在水環境中，并且可能被遷徙的候鳥攜帶進行更廣泛的傳播，也會在霍亂弧菌毒力菌株的進化中發揮重要的作用。

沙門菌是世界范圍內最常見的食源性疾病的病原菌，分為不同的血清型。本研究中鑒定的3種毒力相關基因，invA和ttrBCA存在于所有血清型的菌株中，也是沙門菌屬最常用的特異性鑒定基因[9-10]。而sefA是沙門菌SEF14菌毛的編碼基因，該菌毛主要存在于腸炎沙門菌(S.Enteritidis)和禽病相關血清型等O抗原D1群的菌株中[14]。本次分離的菌株都不攜帶該菌毛的編碼基因，初步判定并非腸炎沙門菌和引起雞白痢和禽傷寒的S.Pullorum和S.Gallinarum等主要禽病相關的血清型。下一步的工作中，擬使用沙門菌屬的診斷血清試劑盒鑒定本次分離菌株的血清型，并評估其感染致病的風險。

本次的野生水鳥死亡事件，經實驗室檢查排除禽流感等高風險的病毒性感染，分離到霍亂弧菌和沙門菌等可導致人類腸道感染的病原細菌。具體的病因還有待商榷，因為并不是所有的鳥類都分離到統一的病原菌，病死鳥解剖也沒有觀察到典型的禽類沙門菌病或產氣莢膜梭菌感染導致的多臟器的炎癥、壞死和出血等病變。推測病因可能是環境應激或者食物匱乏等因素導致的鳥類自身抵抗力下降并伴有病原菌的入侵等綜合因素。但是通過本次事件，遷徙的鳥類攜帶的病原細菌對水源環境和水產養殖可能造成的污染，繼而導致的生物安全和公共衛生問題值得關注。本次發現的骨頂雞、鸕鶿和紅嘴鷗等死亡鳥類都是北方常見的夏候鳥，一些抵抗力弱的鳥類死亡可能污染當地水質，而其它候鳥隨著遷徙季節到來還可能將這些病原細菌擴散到更大的范圍。因此，對遷徙鳥類及其主要棲息地的水質等進行持續的監測是保護生態環境重要的環節。