福氏志賀菌PFGE和MLVA分子分型方法的應用與評價

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細菌性痢疾(菌痢)是由志賀菌屬感染引起的一種常見腸道傳染病。全球每年發病人次估計達1.65億，死亡約110.6萬，0～10歲兒童占總發病數的40%以上，死亡人數69%為5歲以下的兒童。因腹瀉死亡病例中約有75%是由志賀菌感染引起的，發展中國家發病率較高，從近年的監測數據表明我國菌痢的總體發病率雖有下降的趨勢，但菌痢的發病率仍顯著高于發達國家[1-2]。2012年國家級監測點病原監測結果顯示：我國以福氏志賀菌為主(69.93%)，宋內志賀菌次之(30.07%)，未分離到痢疾志賀菌和鮑氏志賀菌；福氏志賀菌以福氏2a為主(53.33%)，菌型分布存在地區差異[3]，前者仍是我國菌痢的主要血清型。隨著分子生物學的不斷發展，多種分子分型方法已應用于細菌性病原菌的分型研究中，如PFGE、MLVA、MLST等已廣泛應用于傳染病爆發溯源及流行監測。本研究選擇2005-2015 年分離自福建地區的43 株福氏志賀菌，應用PFGE和MLVA兩種方法進行分子分型研究，對兩種技術在福氏志賀菌的分型能力和應用價值進行比較和評價，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 2005-2015年福建地區菌痢監測中收集到的福氏志賀菌43 株，均為歷年腸道門診散發病例中分離的菌株。血清型分布：F4c 17株、F2a 14株、F1a 5株、F2b2株、Fx4株、Fy1株。所有菌株均經生化反應及血清學鑒定后保存。

1.2主要試劑和儀器 營養瓊脂購自北京陸橋公司，NotⅠ和XbaⅠ限制性內切酶購自NEB公司，Seakem Gold Agarose PFGE 級瓊脂糖購自Cam Brex公司，蛋白酶K購自Merck公司，引物由上海生工公司合成，PCR Premix反應體系購自TaKaRa公司，所有試劑均在有效期內。

Bio Rad公司的CHEF MAPPER脈沖場凝膠電泳儀和Gel Doc XR+ 凝膠成像系統，法國BioMerieux Vitek公司的DENSIMAT細菌濁度儀。Life Technologies公司的ProFlex PCR system，中國臺灣光鼎公司BiOptic Qsep100毛細管電泳儀。

1.3 方法

1.3.1脈沖場凝膠電泳技術(PFGE)分型 根據 PulseNet (美國CDC)網絡實驗室推薦的福氏志賀菌標準方法并予以條件優化[4]進行PFGE試驗,并做部分優化。采用NotI限制性內切酶(30U)對實驗菌株進行酶切，標準菌株H9812采用XbaI限制性內切酶(40U)酶切，主要實驗參數為電壓梯度6 V/cm，電泳夾角120°，電泳溫度14 ℃。電泳參數：5 s～35 s，18.5 h。

1.3.2多位點可變數目串聯重復序列分型(MLVA) 挑取在營養瓊脂培養基上培養18～24 h的菌落，置于200 μL超純水中重懸，煮沸10 min后，13 000 r/min 離心10 min，取上清作為PCR擴增反應的DNA模板。根據文獻[5]選取8個VNTR位點進行PCR檢測，采用20 μL反應體系，包括Premix 10 μL、上、下游引物(20 μmol/L)各0.4 μL、模板2 μL、超純水9.2 μL。反應條件：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，30個循環，最后72 ℃ 10 min。應用毛細管電泳讀取PCR產物大小，根據福氏志賀菌301標準株的基因組(GenBank Accession No.AE005674)作為參照，計算每株菌各VNTR位點的重復單位數，每個菌株8個位點的重復數組成一組數字編碼作為MLVA等位基因類型。根據不同菌株VNTR的多態性進行分型分析。見表1。

表1 福氏志賀菌8個VNTR位點信息Tab.1 Information of 8 VNTR sites of Shigella flexneri

表1(續)VNTR位點引物(5′-3′)雙側側鏈長度/bp核心序列長度/bpSF9F:CAAATGGTAACGTCGCATCAR:ATGGGATTGCTGCGTAACAC2109SF10F:CGGGAACCGTTTTGTATCAGR:AAGGACGCACGTCAAATACC1146SF25F:GAGCAGGGATCCGTCATTTAR:CGTGATGATTTCCGAGGTGT2295

利用毛細管電泳得到各引物擴增片段的長度后，每個位點選擇兩株菌進行序列測定，將測序結果驗證毛細管電泳后換算得到的重復數。

1.3.3MLVA與PFGE數據分析 使用BioNumerics(Version 6.6)軟件處理PFGE圖譜，選擇Dice相似性系數和UPGMA方法進行聚類，tolerance設置為1.5%。對MLVA數組采用Categorical(Values)相似性系數和UPGMA方法構建聚類圖和最小生成樹。

1.3.4Simpson分辨系數(index of diversity，DI) 兩種方法的分辨能力采用基于Simpson的分辨系數(index of diversity，DI)，即D 值來表示[6],計算公式為：

注：N 代表聚類菌株總數，s為型別數，nj為某一型別的菌株數。

2 結 果

2.1 PFGE分析

2.1.1PFGE分型結果 43株福氏志賀菌用NotⅠ酶切并進行脈沖場電泳后，DNA片段可得到較好地分離，可見大小不一的電泳條帶，菌株條帶數目在12～22之間。利用Bionumerics軟件的Cluster analysis模塊進行聚類分析，菌株間條帶相似度在61.70%～100%之間；按照100%的相似度可將菌株酶切圖譜分為36個PFGE型，各型包含1～2株菌不等，記為P1～P36。各血清型菌株均無優勢的PFGE型別。見圖1。

圖1 43株福氏志賀菌PFGE分型聚類圖Fig.1 Cluster map for PFGE type among 43 strains of Shigella flexneri

2.1.2優勢PFGE簇的特征 根據聚類結果部分菌株酶切圖譜可劃為同一個簇，得到4個主要的PFGE簇：G1、G2、G3和G4，分別有4種(4株)、10種(15株)、6種(7株)和4種(4株)PFGE型別，4簇共占到福氏菌株總數以及PFGE 型別總數的69.77%(30/43)和66.67%(24/36)。G1和G3簇以F2a為主，占各到菌株數的100%(4/4)和71.43%(5/7)； G2和G4簇以F4c為主，各占到菌株數的73.33%(11/15)和100%(4/4)。

2.1.3PFGE分型與血清分型的關系 不同血清型的菌株基本可分為不同的PFGE型別，也有極少數不同血清型歸為同一PFGE型別，如P7型中包含1株F4c和1株Fx。F2a血清型菌株有11株歸于G1和G2簇，有3株歸于其它型別；F4c菌株有15株歸于G2和G4簇，有2株歸于其它型別。

2.2 MLVA分析

2.2.1MLVA分型結果 經聚類分析后，按照100%的遺傳關聯度可將43株菌株分為41個MLVA型別，記作MT 1～MT 41，遺傳關聯度介于6.207%～100%之間，各型別包含1～2株菌，表現出明顯的遺傳多樣性。43株福氏志賀菌根據聚類結果可歸為5個基因群(Cluster1～5)，各基因群菌株血清型并不均一，每個群都含有不同的血清型，Cluster1內菌株存在較大多態性。但群內也存在優勢的血清型別，其中Cluster 1 基因群以F2a為主，占到菌株總數的62.5%(10/16)；Cluster 2和Cluster 4以F4c為主，分別占到菌株總數的60.0%(3/5)和70.0%(7/10)。見圖2。

圖2 43株福氏志賀菌MLVA分型聚類圖Fig.2 Cluster map for MLVA type among 43 strains of Shigella flexneri

2.2.2最小生成樹 利用軟件構建最小生成樹，大部分F1a和F2a的型別位于最小生成樹的主干上，部分F4c與Fx親緣關系較近，二者大多位于末端分支上，并都由F2a和F1a分支而來，表現出一定的遺傳關系；F4c內部各菌株之間也表現出遠近不等的親緣關系。見圖3。

注：線條的粗細和長短表示基因遺傳距離的遠近，粗線條和短線條表明遺傳距離更近；細線條和長線條表明遺傳距離更遠；圓圈大小表示相同型別含有菌株的多少。

2.3PFGE與MLVA分型的比較 43株福氏志賀菌PFGE和MLVA分型方法的多態性指數D值分別為0.992 2和0.997 8。PFGE聚類圖可分為G1～4 4個PFGE簇，MLVA聚類圖可分為Cluster1～5 5個基因群， G1和G3中的F2a血清型分別包含4個和6個PFGE型，而在MLVA分型中則分為Cluster1(7個型)、Cluster3(2個型)；G2和G4中的F4c血清型分別包含8個和4個PFGE型，而在MLVA分型中則分為Cluster1(2個型)、Cluster2(3個型)、Cluster3(2個型)和Cluster4(7個型)。

部分菌株具有相同的MLVA型別和相同的PFGE型別，如P10型、P36型分別與MT29型、MT40型所含菌株對應，但也存在部分菌株具有相同的PFGE型別，卻分為不同的MLVA型別，如P7、P8、P11、P13和P19所含菌株被分為不同的MLVA型別。

3 討 論

福氏志賀菌血清型種類較多，至少可被分為20種[7]，近年來，我省出現一些新發血清型，如F4c、Fx、Fy[8]等，并且研究表明我省分離的大部分F4c志賀菌具有較強的毒力特征，某一克隆群的F4c菌有可能逐步演變成為我省主要且穩定的福氏志賀菌流行菌株[9]。因此應用新的分型方法研究志賀菌尤其是新發福氏血清型在分子水平的菌型分布，優勢菌型的相似性與親緣關系，逐步建立志賀菌分子識別數據庫已成為志賀菌疫情防控的迫切需要。PFGE對細菌的分型能力強、易于標準化，可以有效判斷菌株之間的親緣關系遠近，被譽為細菌分子分型技術的“金標準”。多位點的可變串聯重復(MLVA)分析是近年發展起來的以PCR技術為基礎的分子分型方法，由于其操作簡單、快速、可重復性好、分辨率高并且不同的實驗室之間結果易于比較等優點，已應用于多種細菌的分子分型[10]。辛普森指數可作為評價某種分型方法分辨率高低的指標，當辛普森指數D值大于0.9即可認為該分型方法可信和具有較好的分辨能力[11]。本研究運用PFGE技術對43株福氏志賀菌進行分子分型，得到36個PFGE型，不同血清型菌株被分為不同的PFGE型別，D值為0.992 2；運用MLVA技術把43株福氏志賀菌分為41個MLVA型別，D值為0.997 8。從分型效果來看，PFGE和MLVA都可以在血清分型的基礎上將菌株進一步細分，如PFGE和MLVA將14株F2a分別分為12個型和14個型，將17株F4c分別分為13個型和15個型，顯示出較好的分型能力，MLVA分辨力略高于PFGE，二者均可應用于福氏志賀菌的分型研究。

兩種分子分型結果均顯示福氏志賀菌呈現基因組的多態性，一方面同研究菌株為散發病例分離株相吻合，另一方面說明在福建省腹瀉人群中流行的福氏志賀菌在流行傳播過程中存在著基因變異現象，形成基因組流行形式的多樣性。進一步的聚類表明兩種分子分型都有優勢的型別簇或者基因群，PFGE聚類中可出現 4個優勢簇G1-G4，結合流行病學資料分析，優勢簇分類結果與福氏志賀菌的血清型別有比較好的重疊性，并在時間和地區分布上呈現出一定規律。G1簇全部為分離自2010、2013和2014年薌城地區的F2a菌株，G3簇也以2009-2014年薌城F2a分離株為主；G2和G4簇各以2007-2010年和2005-2007年分離的F4c為主，沒有明顯的優勢地區分布，說明福氏志賀菌在流行傳播過程中存在不同年代、地區優勢的克隆分化群，某些血清型別可能演變為具有一定流行能力的菌株，PFGE在研究福氏志賀菌流行趨勢和能力方面具有一定應用價值。MLVA聚類中各基因群菌株血清型并不均一，每個群都含有不同的血清型，Cluster1菌株存在較大多態性，其它各群血清多態性也比較明顯；各優勢基因群中菌株分離年份和地區沒有特殊規律，其原因可能是在未發生爆發流行的情況下，外環境選擇性壓力導致菌株自身變異度較高，菌株可變串聯重復基序數目波動很大，因而MLVA多態性明顯。

PFGE分子分型針對的是全細菌的基因組，對于同一次暴發流行的菌株，理論上菌株的基因組應該表現為100%的相似度，但是PFGE無法檢測基因組結構和序列差異的能力，所以不能闡明兩個帶型不同的菌株之間是否存在進化關系。另外，PFGE分型中，Fx和Fy與其它血清型指紋圖譜的相似度較低，而MLVA最小生成樹則揭示F4c、Fx與F2a、F1a具有一定的遺傳進化關系，表明MLVA方法在分析菌株的親緣進化關系方面具有一定的優勢，提示我們可以結合MLVA分型與傳統的血清學分型來分析菌型進化變遷的規律和發現新的菌株。雖然PFGE廣泛應用于暴發疫情中病原菌的溯源和調查處置，但PFGE試驗操作繁瑣、耗費時間、成本較高，對結果的分析有時需要人工判斷。本研究MLVA試驗中采用8個VNTR位點，并優化了PCR擴增條件，操作簡便，結果客觀，可用于實驗室間數據的比對，在分辨率上也略優于PFGE技術，在福氏志賀菌的分子分型和揭示菌株種群進化的內在關系上有較高的應用價值。

根據菌株的流行病學背景資料，本次研究選取的菌株大都來自散發病例，缺乏來自暴發流行及分離自食品的菌株，對兩種分型方法在志賀菌暴發流行的分型及溯源調查的能力尚待進一步評價；另外還需增加各血清型菌株及分離地區的數量以完善兩種分型方法的評價。在今后的監測工作中，可將PFGE和MLVA分型相結合，不僅能在早期監測到病原菌的爆發疫情，為及時啟動流行病學調查和開展防控措施提供依據，還能有助于追蹤志賀菌亞型的流行趨勢，分析優勢菌群及菌株的遺傳多態性，及時發現新亞型的出現。