基于matK序列的婆婆納屬部分植物親緣關系分析

許 靜，趙月梅

(1.西安市第十中學，陜西 西安 710014；2.商洛學院 生物醫藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

婆婆納屬(Veronica)植物屬于玄參科，約有250個種[1]，廣布全球，主產于歐亞大陸。我國有61種，各省均有分布，主產于西南山地。該屬植物中，有外來雜草，如睫毛婆婆納(V.hederifolia)、波斯婆婆納(V.persica)；有傳統藥用植物，如水苦荬(V.undulate)、婆婆納(V.didyma)等。具有止血活血，清熱解毒，生肌，祛風利濕等功效[1]，本屬植物多生于灌木叢、樹林下以及河溝、山谷旁。

據《中國植物志》[2]記載，中國的婆婆納屬植物共分為8個組，分別為：穗花組、頭花組、小婆婆內組、蚊母草組、婆婆納組、沼生組、狹果組、疏花組。一般認為，除了狹果組外，其余種內和種間之間的界限均比較清楚。形態上鑒別婆婆納屬植物的方法主要為葉的形態，葉柄，花柄，果柄的長短，花的顏色大小，果的形態以及葉柄根的構造，葉片上下表皮的氣孔數目等性狀[3]。但是有些物種由于分布廣，不同分布區環境存在差異，為了適應當地的生態環境，該物種的相關性狀在不同類群之間會呈現不連續性。加上物種分化時間短，近緣物種之間存在基因流等原因，導致部分物種的種間關系比較模糊。因此僅依靠傳統的形態學鑒別手段，很難對該屬物種進行精確的區分[4～5]。

隨著測序技術及分子生物學、分子系統學等學科的發展，在DNA水平上，利用合適的分子標記對近緣物種進行種間及種內序列分析，是解決物種間系統關系及分類的有效方法[6～10]。葉綠體matK基因是植物學系統分析中常用的序列之一，研究表明，該基因編碼的酶參與RNA轉錄體中Ⅱ型內含子的剪切[11]，且由于該基因的變異較均一，在構建系統進化樹時能提高聚類樹的可靠性[11]，近年來廣泛應用在了不同植物屬內種間、種下的系統發育系研究[12-19]。研究擬利用matK基因分析婆婆納屬部分植物的系統發育關系，旨在探討該屬植物的在形態上難以解決的種間親緣關系和分類界限，為該屬植物的傳統分類學及進一步應用和保護提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

本研究采用了婆婆納屬植物的16個種(36條matK序列)，其中婆婆納，阿拉伯婆婆納，北水苦荬樣品采集自陜西商洛，其余13個物種的序列均從NCBI下載，上述3個物種的樣品經野外采集新鮮葉片后，裝入采集袋中用硅膠快速干燥，備用。

1.2 總DNA提取PCR擴增及序列測定

將婆婆納、阿拉伯婆婆納、北水苦荬三個物種的干燥葉片用天根公司植物DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech Co., China)提取樣品總DNA。PCR擴增的引物及擴增條件及擴增體系參考以前研究成果[20]。擴增、純化得到的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海生物工程技術服務有限公司進行單向測序。

1.3 數據分析

將測序所得序列和下載序列進行整理后構建FASTA格式的文件，用Clustal 2.0[21]軟件進行比對后截掉前后多余的序列，組成長度一致的矩陣，備用。用Bioedit[22]軟件和Mega6.0[23]軟件進行序列變異位點的分析，并計算種間及種內距離，構建系統發育樹。

表1 婆婆納屬樣品來源

注：*表示該物種目前無中文名稱

2 結果與分析

2.1 matK序列堿基組成分析

將得到的matK序列進行剪切，序列比對及后獲得約733 bp長度的序列，發現該序列存在多處變異位點及1處插入缺失位點(圖1)。其中序列中T、G、A、C的平均含量分別為36.9%、17.5%、28.9%、16.6%，變異位點167個，約占總序列的22.78%，整個matK區的變異位點豐富，可以較好地區分不同種質來源的婆婆納屬植物。

(1)在種內，其中婆婆納、阿拉伯婆婆納、北水苦荬、每條序列完全相同，即這些物種無種內變異:；睫毛婆婆納在86位點發生了種內變異(A-G)；石蠶葉婆婆納在667位點出現了變異(T-G)；有柄水苦荬在435位點出現了堿基缺失。

(2)在種間，睫毛婆婆納、V.Spicata、V.Barrelieri、在148位點出現了變異(G-A)；阿拉伯婆婆納、有柄水苦荬在624位點出現了變異(G-T)；小婆婆納、睫毛婆婆納、在624位點出現了變異(G-A)；石蠶葉婆婆納在624位點出現了變異(G-C)。

圖1 婆婆納屬16個物種matK序列信息

2.2 matK序列遺傳距離分析

用Mega6.0軟件計算的婆婆納屬16個種的種間遺傳距離(表2)：16個婆婆納屬植物的遺傳距離范圍在0.002-0.101之間，其中1與15之間，即藥用婆婆納V.Officinalis和V.Dabneyi之間遺傳距離最小，為0.002，表明二者親緣關系較近，其次2(美洲婆婆納V.Americana)與7(有柄水苦荬V.Beccabunga)之間、9(北水苦荬V.Anagallis-aquatica)與12(V.Catenata)之間、10(穗花婆婆納V.Spicata)與14(V.Barrelieri)之間遺傳距離都比較小，分別為0.003、0.003、0.004。另外，4(婆婆納V.Polita)和8(睫毛婆婆納V.Hederifolia)之間遺傳距離最大，為0.101，表明二者親緣關系最遠。

表2 基于matK序列的婆婆納屬種間的K2P遺傳距離統計結果

注：1-16個種的順序同表1

圖2為種間距離和種內距離的頻率分布圖，由此可知，matK序列在婆婆納屬中的種內距離集中在0%～0.5%區間，種間距離集中在0.5%之后，二者在0.5%～1.0%區間有少許重疊，且無論種內距離還是種間距離在該區間的分布都較少(小于10%)，表明matK序列在婆婆納屬的遺傳距離分布上比較好：即種內距離偏小而種間距離偏大，適合做系統發育和分類分析。

圖2 婆婆納屬植物種內、種間的遺傳距離分布頻度柱形圖(其中橫坐標為遺傳距離，縱坐標為該遺傳距離的分布頻率)

2.3 系統發育分析

由Mega 6.0軟件基于鄰接法構建的系統發育樹(圖3)顯示，16個種的36條序列能將每個物種分別聚成一個單系，且支持率較高。其中睫毛婆婆納位于枝的最底端，表明該物種在該屬中較為原始，與其他物種關系較遠；剩下的分枝中，石蠶葉婆婆納，婆婆納和阿拉伯婆婆納三個物種聚為一支，同時，剩下的12個物種聚為一支，二者形成并系，表明兩個分枝間存在平行進化關系。在阿拉伯婆婆納的分枝中，婆婆納與石蠶葉婆婆納關系較近，二者聚為一支，同時與阿拉伯婆婆納形成并系；在12個物種形成的分枝中，形成2個亞分支，亞分支1：有柄水苦荬、美洲婆婆納、V.Catenata、北水苦荬、蚊母草、小婆婆納、V.Barrelieri和穗花婆婆納聚為一個亞分支，其中，有柄水苦荬與美洲婆婆納之間親緣關系較近，V.Catenata與北水苦荬之間親緣關系較近，蚊母草，小婆婆納、穗花婆婆納和V.Barrelieri依次關系較遠。亞分支2：其余的物種V.Scutellata、藥用婆婆納、V.Dabneyi和V.Montana聚為另一個亞分支，其中V.Dabneyi和V.Montana關系較近，隨后依次為藥用婆婆納、V.Scutellata物種。由此可知使用matK序列可以在系統發育上闡明婆婆納屬這16個物種的親緣關系，且大部分分支支持率較高。

圖3 基于matK序列的婆婆納屬系統發生樹(注：1-16物種順序見表1)

3 結論

本文利用matK序列分析了婆婆納屬16個物種(共36條序列)的系統發育關系，其中包括序列特征、K2P距離及系統進化樹。結果表明：從實驗過程上來說，野外采集的北水苦荬、婆婆納和阿拉伯婆婆納3個物種在DNA提取及PCR擴增過程中均表現良好，通用引物在該屬這3個物種中均能正常使用，在上述的反應條件和反應體系均能很好的擴增條帶并正常測序，表明這3個物種區段的引物結合區域未出現變異等情況，可正常結合并擴增。在采樣不足的情況下，在Genbank中也有豐富的序列信息可供參考。從序列對比上來看，對比后的總長度為733 bp，相對于其他物種來說，序列長度屬中等，1個插入缺失序列，167個變異位點，表明該屬的物種進化較快。種內距離集中在0.5%以內，種間距離集中在0.5%以外，表明該序列在種內距離小在種間距離大，比較適合做系統發育分析。最后聚類樹分析也表明該屬物種中睫毛婆婆納較為原始，阿拉伯婆婆納、婆婆納和石蠶葉婆婆納與剩余的12個物種呈現平行進化趨勢。

婆婆納屬植物分布廣泛，在全世界各地均有分布，其中有重要的中藥材，也有用于園林，環保等方面的重要植物，而該屬植物多為草本，形態上有很多相似之處，因此在分類上造成了很多互相混淆的現象，尤其是廣布于的婆婆納和阿拉伯婆婆納物種，在非花期和果期很難將二者進行準確的區分。而利用各種分子標記的方法則有助于在宏觀分類方面區分這些形態上和進化上相似的物種，同時也可以闡明近緣物種間的復雜的系統發育關系，matK序列在該領域中是一種常用的序列，在很多藥材及園林植物中都得到了重要的應用，本文的研究除了闡明婆婆納屬植物的系統發育關系外，同時能夠為matK序列的應用范圍和鑒定能力提供一個很重要的參考依據。