蒙古馬高負荷運動訓練前后COX4I2、FABPpm和CAV-1基因表達量的研究

李 超，其日格日，趙啟南，烏英嘎，康德措，趙一萍，格日樂其木格，芒 來

（內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，農業農村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學觀測實驗站，內蒙古農業大學馬屬動物研究中心，內蒙古呼和浩特 010018）

在生物氧化的電子傳遞過程中，細胞色素C氧化酶4（COX4）是電子傳遞鏈上復合體4的1個關鍵亞基，它由COX4基因編碼，主要功能把呼吸底物的電子經過細胞色素系統直接傳遞給分子態氧[1]。研究表明，COX4蛋白共有2個異構體，即COX4I1和COX4I2，兩者在體內起到相反作用。在缺氧條件下COX4I1基因的表達被COX4I2基因所抑制，而在有氧條件下COX4I1基因率先表達[2]。膜脂肪酸結合蛋白（FABPpm）是由FABPpm基因編碼了分子量為43 ku的FABPpm膜蛋白，主要定位在細胞質膜和線粒體膜上。Glatz等[3]指出，脂肪酸跨膜運輸的基本過程是脂肪酸先與白蛋白形成復合體，再與質膜上的白蛋白形成結合白蛋白，最后脂肪酸被釋放并被FABPpm蛋白轉運至胞內。因此，認為FABPpm的表達水平與脂肪酸代謝水平密切相關。小窩是位于細胞膜上的頸狀凹陷囊泡結構，小窩蛋白-1（CAV-1）是小窩主要結構蛋白和調節成分。CAV-1的α和β亞基均能結合脂肪酸，斷定CAV-1是一種脂肪酸結合蛋白[4]，其主要作為脂筏的組成蛋白，并以脂筏為平臺直接結合游離脂肪酸，參與脂肪酸的轉運[5]。綜上，COX4I2、FABPpm和CAV-1基因在分別在與高負荷運動相關生物氧化過程和脂肪酸分解過程中發揮了重要作用。

蒙古馬作為耐力運動能力較為出色的馬種，在高負荷運動中ATP的合成及脂肪酸的分解過程都極為重要。但以上3種基因在蒙古馬中的研究較為少見，尤其是在高負荷運動訓練前后基因表達量差異的研究還未見報道。本研究選取蒙古馬臀中肌中與運動有關的3個基因（COX4I2、FABPpm和CAV-1）作為候選基因，檢測高負荷運動訓練前后轉錄水平mRNA的表達量，為今后馬運動訓練與基因表達相關方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和訓練方法 實驗選擇3匹5歲雌性蒙古馬，高負荷運動前，空腹狀態下將馬匹麻醉后從臀中肌中采集肌肉樣品（30 g），樣品離體后，蒸餾水洗凈并迅速剪成豆粒大小，放入已編號的無RNase Ep管中（Eppendorf），并置于液氮罐中帶回實驗室放入-80℃冰箱（Eppendorf）中保存。

待馬匹得到充足休息后，開始進行高負荷運動訓練。運動訓練在一個直徑30 m，周長100 m的圓形調教圈中進行。 訓練期4個月，共計122 d，為避免運動損傷，訓練計劃將分為3個階段，每階段分若干周期，逐步提高運動訓練強度。第1階段為第1～15天：此階段總計15 d，每5 d為1個周期，第1周期第1天運動8 km，第2～4天每日遞增2 km，第5天休息；第2和第3周期訓練循環方式同第1周期。這個階段訓練的主要目的是使肌腱、韌帶和骨骼能夠得到強化，幫助馬匹適應后面的高強度訓練。第2階段為第16～108天：此階段總計92 d，每4 d為1個周期，起始訓練距離為15 km，每個周期中前3 d每日訓練距離以5 km遞增，第4天休息，如此循環。此階段訓練是為了使肌肉有氧適應性最大化，距離逐步增加，并及時下降回歸，讓訓練馬匹得到休息。使肌肉、心臟和肺臟等器官能夠適應遞增的高強度運。第3階段為第109～122天：此階段總計14 d，在這個階段要盡可能延長訓練時間和訓練距離，起始訓練距離為20 km，第2～4天訓練距離以 10 km 遞增，第5、6天休息，該階段結束后，采取樣品，方法同1.1。

實驗用馬在訓練期間每天飼喂5次青干草，白天4次，夜間補飼1次，草量以半小時內吃完無剩余為準；每天飼喂 1 次精飼料，精飼料包括玉米、燕麥與麩皮，按照 4:4 :2 加水攪拌潮濕后供給，隔天在精飼料中加入葵花籽和食用鹽。不限制飲水量，飲水經常更換以保持新鮮；馬廄內長期掛鹽磚和糖磚供其自由舔舐，補充微量元素。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA的合成 首先，將凍存在-80℃的蒙古馬臀中肌肌肉樣品放入裝有液氮的研缽中，根據Trizol試劑（TaKaRa）總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，1%瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性，微量紫外分光光度計（Thermo NANODROP 2000c）測定提取的總濃度。其次，使用RNA反轉錄試劑盒（TaKaRa）進行cDNA的合成，反應體系：5×PrimeScript Buffer2 4.0 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 μL、RT Primer Mix 1.0 μL、RNase Free dH2O 4.0 μL、總RNA 10.0 μL，總反應體系為20 μL。反應條件為37℃、15 min，85℃、5 s，溫度降到4℃時終止反應，經凝膠電泳檢測后反轉錄產物在-20℃冰箱里保存備用。

1.2.2 引物設計 分別根據馬運動相關的文獻記錄[6]，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，NC_009149）基因為內參基因，并選取肌肉中與馬高負荷運動相關的3個基因為候選基因，即COX4I2（NC_009165.3）、FABPpm（NC_009146.3）和CAV-1（NC_009147.3），使用Primer Premier 3.0軟件設計引物，并且通過NCBI中的Blast功能，檢測各引物的特異性。設計完后由上海生物工程有限公司合成，具體引物信息見表1。

1.2.3 普通PCR 使用cDNA作為模板進行PCR擴增，擴增基因的目的片段采用三步法PCR擴增程序，95℃預變性5 min，98℃變性10 s，按各基因相應的退火溫度（表1）退火30 s，72℃延伸1 min ，進行30個循環后4℃保存備用。

1.2.4 實時熒光定量PCR 熒光定量PCR是采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa）在實時熒光定量PCR儀（Agilent Technolog-ies Strata gene Mx3000P，Agilent）上進行。反應體系總計20 μL：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，cDNA模版2.0 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，ddH2O 6 μL。每個樣品重復3管。

1.3 數據分析 實驗采用 2-ΔΔCt（ΔCt=Ct目的基因—Ct內參基因）并以GAPDH為內參基因對蒙古馬肌肉中與運動相關的3個基因進行運算和矯正。將得到的數據采用Excel 2016軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗，并利用GraphPad Prism 6進行繪圖。

表1 引物序列參數

2 結 果

2.1 總RNA質量檢測 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA樣本呈完整清晰的28 S、18 S和5 S條帶（圖1-A），反轉錄后cDNA電泳圖見圖1-B。

圖1 蒙古馬臀中肌總RNA和反轉錄后cDNA

2.2 運動相關基因mRNA的相對表達量 由圖2可知，高負荷運動訓練后蒙古馬臀中肌中COX4I2、FABPpm和CAV-1基因表達量均存在升高趨勢，其中COX4I2和FABPpm差異顯著（P＜0.05），而CAV-1在統計學上差異并不顯著（P＞0.05）。

圖2 訓練前后蒙古馬臀中肌中運動相關基因mRNA相對表達量

3 討論與結論

近年來，關于COX4I2基因與運動關系的研究較多集中于人和小鼠以及純種馬上。COX4I2基因具有組織特異性，其在肌肉組織中的表達量顯著高于其他組織[7]。研究表明，對8匹未經訓練的純種馬進行標準化的漸進式踏車運動訓練后，COX4I2基因在肌肉中的表達量顯著高于運動前[8]。曹行[9]研究發現，伊犁馬的COX4I2基因存在遺傳多樣性，其不同的基因型對伊犁馬的運動能力有較大影響。因而，無論是COX4I2基因在肌肉組織中特異性高表達，還是通過運動訓練提高了COX4I2基因表達量，以及不同基因型對動物運動能力的影響都印證了COX4I2基因與運動訓練和能量代謝具有相關性，即COX4I2基因表達的增加為機體提供了更多的熱量來保持體溫及維持能量。本研究發現，在為期4個月的高負荷運動訓練后，蒙古馬臀中肌中COX4I2基因的表達量顯著提高。由此可見，通過長期高負荷運動訓練，能夠增強線粒體活性，提供運動所需的能量。

Talanian等[10]對10名女性進行6周的高強度間歇訓練后，骨骼肌細胞內FABPpm含量增加了48%。關于一次性力竭運動的研究表明，120 min的力竭運動可以使人類和大鼠質膜上的FABPpm蛋白含量分別增加20%和30%[11]。這說明FABPpm基因表達的增強與運動具有很大的相關性，不同的運動方式對FABPpm表達影響都具有相同的趨勢，即FABPpm含量都增加；同時也可以看出，高強度間歇訓練相比一次性力竭運動有更大影響。在生物體內，FABPpm基因表達可以被腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated Protein Kinase，AMPK）激活，AMPK 信號通路是調控脂肪代謝的關鍵通路[12]。FABPpm表達的升高很有可能是由于肌肉運動刺激AMPK，而后AMPK刺激FABPpm表達。本實驗中，長期高負荷運動訓練后蒙古馬臀中肌中FABPpm基因表達有顯著提高，這與以前的研究[10-11]基本一致，即運動增強了FABPpm基因在肌肉中的表達，因而長期高負荷運動在一定程度上能促進機體中脂肪的代謝。

CAV-1與脂肪代謝有著密切的關系。在動物實驗中，CAV-1缺失的小鼠表現出明顯的代謝紊亂，并且脂代謝嚴重受阻[13]，這表明CAV-1與脂肪代謝有密切關系。張荷等[14]研究表明，低氧運動可以顯著增加大鼠肌肉中CAV-1蛋白含量，而在常氧的運動狀態下大鼠CAV-1蛋白含量雖有增加，但增加趨勢不顯著。Oh等[15]研究發現，抗阻訓練運動后CAV-1基因的表達與小鼠的肌肉纖維類型有關。本實驗結果顯示，蒙古馬高負荷運動后，CAV-1基因表達量升高，但不顯著。這可能是由于肌纖維類型差異所致，臀中肌中Ⅰ型、Ⅱa型和Ⅱx型肌纖維以不同比例存在；也可能由于運動訓練方式差異所致。

綜上所述，COX4I2、FABPpm和CAV-1基因與蒙古馬的運動能力存在密切關系，可為今后蒙古馬運動訓練和相關基因的研究提供有價值的參考依據。