甲潑尼龍琥珀酸鈉對急性原發免疫性血小板減少癥患者Tr細胞分化及FoxP3基因表達的影響

張 琳，徐大明，李天宇，張 茜，溫大科，李方方，郭豆豆，楊 燕，包 鴻

(江蘇省無錫市兒童醫院兒血液內科 214023)

急性原發免疫性血小板減少癥(acute idiopathic thrombocytopenic purpura,AITP)為兒童常見的出血性自身免疫性疾病之一，其發病機制尚不明確，多數學者認為該疾病的發生與自身存在識別自身血小板抗原的自身抗體有關，致自身抗體與抗原結合，使血小板壽命縮短、破壞增加，導致血小板數量急劇減少[1]。研究發現[2-3]，AITP患兒體內多伴有多種T淋巴細胞異常，尤其是T細胞亞群功能及比例失調，在AITP發生發展過程中起著重要作用，當體內激活的淋巴細胞未及時凋亡，可引起機體自身免疫反應，進而引起T細胞清除缺失，導致血小板被持續性破壞。糖皮質激素應用于治療AITP，療效顯著，安全性高，成為臨床中治療AITP的主要策略，其具體機制尚不明確[4]。既往研究認為[5]，糖皮質激素通過抑制自身免疫細胞過度活化和中和抗血小板抗體而發揮免疫調節作用，但是關于糖皮質激素的作用機制是否與調節性T(regulatory T,Tr)細胞有關尚不明確。因此，本文將通過檢測AITP患兒甲潑尼龍琥珀酸鈉治療前、后Tr細胞比例、相關細胞因子、FoxP3基因表達水平的變化,探討Tr細胞在AITP發病中的意義及甲潑尼龍琥珀酸鈉對其的影響?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 本次研究通過江蘇省無錫市兒童醫院倫理委員會審核批準。納入標準：(1)符合AITP診斷標準[6][即起病急，伴有發熱；以自發性皮膚、黏膜出血為主，多為針尖大小的皮內及皮下出血點，鼻、牙齦、胃腸道出血少見，可伴有肉眼血尿；淋巴結不大；該病呈自限性經過，約1～6個月可自愈；血小板計數小于40×109/L，可見大、變形血小板，壽命縮短；血小板相關免疫球蛋白(PAIg)陽性率約80%以上；骨髓巨核細胞數正?；蛟黾覿；(2)年齡3～7歲；(3)同意入組研究。排除標準：(1)伴有嚴重基礎性疾??；(2)伴有其他血液病者；(3)對甲潑尼龍琥珀酸鈉過敏者。根據以上納入排除標準，選取本院在2017年1月至2018年1月期間收治的56例AITP患兒作為研究對象(AITP組)，給予以甲潑尼龍琥珀酸鈉治療，并同期選擇56例健康體檢兒童作為健康組。兩組兒童性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。

1.2方法

1.2.1治療方法 入院完善檢查后，均予以抗感染、鈣劑、防出血等綜合治療；AITP組患兒在常規治療基礎上予以甲潑尼龍琥珀酸鈉(國藥集團容生制藥有限公司40 mg注射劑，國藥準字H20030727)5 mg·kg-1·d-1)靜脈滴注，病情控制后(本次研究所用時間為3～5 d)，予以潑尼松片(浙江仙琚制藥股份有限公司 5 mg，國藥準字H33021207)1.5～2.0 mg·kg-1·d-1清晨口服，3～5 d后逐漸減量，直至停服，整個療程約3～4周。

表1 患兒一般情況

1.2.2外周血Tr細胞檢測 收集健康兒童外周血5 mL，以及AITP患兒治療前、后外周血各5 mL，經肝素抗凝，用淋巴細胞分離液(由挪威Axis-shield公司提供)分離外周血單個核細胞，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基稀釋細胞，細胞懸液濃度為1×106/mL，吸取200 μL細胞懸液加入EP管中，分別加入20 μL抗CD4-FITC、抗CD25-PE單克隆抗體，同型對照為IgG1-FITC，IgG1-PE，混勻后避光孵育約25～30 min，經PBS洗滌2次，用0.5 mL PBS重懸細胞，混勻后經流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司CytoFLEXLX型)檢測。

1.2.3FoxP3基因表達水平檢測 采用RT-PCR檢測外周血單個核細胞FoxP3 mRNA表達水平；TRIzol法常規提取外周血單個核細胞總RNA，采用電泳檢測RNA質量，定量后吸2 μg總RNA進行反轉錄合成cDNA，以β-actin(正向引物5′-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3′,反向引物5′-GCT GCT ACC TTC ACC GTT CC-3′)作為內參行PCR反應擴增 FoxP3 mRNA(正向引物5′-CAG CAC ATT CCC AGA GTT CCT C-3′;反向引物5′-GCG TGT GAA CCA GTG GTA GAT C-3′)，擴增目的基因后進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統掃描；PCR反應條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min。

1.3觀察指標 (1)治療效果評價：記錄AITP患兒治療后(即停藥時)外周血血常規血小板計數，出血點、瘀點、瘀斑等皮下出血情況；(2)記錄入組兒童流式細胞儀檢查的外周血T細胞亞群結果；(3)細胞因子檢測：記錄健康兒童外周血FoxP3基因表達水平，以及AITP患兒治療前、后FoxP3基因表達水平。

2 結 果

2.1患兒治療效果比較 AITP組患兒治療后血小板計數較治療前升高(134.18±50.12)×109/L，皮膚黏膜紫癜平均消退時間為(44.01±7.48)h;AITP組患兒治療過程中血壓、血糖、電解質監測均值波動在正常值范圍內。

表2 健康組與AITP組治療前、后外周血Tr細胞亞群檢測結果

t1、P1：健康對照組與AITP組治療前比較；t2、P2：AITP組治療前、后比較

2.2入組兒童外周血T細胞亞群檢測結果 治療前AITP組患兒外周血CD4+CD25+Tr細胞、CD4+Tr細胞、CD25+Tr細胞、CD4+CD25+Tr細胞/CD4+Tr細胞水平低于健康組(P<0.05)，治療后AITP組患兒外周血CD4+CD25+Tr細胞、CD4+Tr細胞、CD25+Tr細胞、CD4+CD25+Tr細胞/CD4+Tr細胞水平高于治療前(P<0.05)。見表2。

2.3入組兒童FoxP3 mRNA表達情況 AITP組患兒FoxP3 mRNA表達水平低于健康組兒童(P<0.05)；AITP組患兒治療后FoxP3 mRNA表達水平高于治療前(P<0.05)。見表3。

表3 入組兒童FoxP3 mRNA表達情況檢測

a：P<0.05，與健康組比較；b：P<0.05，與AITP組治療前比較；-：此項無數據

3 討 論

AITP發病機制尚不明顯，臨床中主要表現為血小板減少，伴有不同程度骨髓巨核細胞增加。AITP為兒童人群中常見的一種自身免疫性疾病，既往研究認為是因自身抗體作用，破壞血小板，近年研究發現，AITP的發生，不僅與體液免疫機制有關，還與細胞免疫有關[7]。目前臨床中治療AITP首選糖皮質激素，其可通過抑制巨噬細胞系統，降低毛細血管的脆性，并抑制血小板抗體形成，從而起到治療效果[8]。臨床中使用的糖皮質激素主要包括潑尼松、地塞米松及甲潑尼龍琥珀酸鈉等，但臨床應用研究發現，潑尼松短期療效尚可，遠期療效欠佳，并且長期服用，不良反應發生風險較高；地塞米松相比于潑尼松，其抗炎、抗過敏、抗毒作用更好，可降低鈉潴留發生風險；甲潑尼龍琥珀酸鈉抗炎作用較強，鈉潴留作用較小，其在血液中的半衰期短，并且對于垂體腎上腺周的抑制作用較小，短期內可大劑量使用[9-11]。

本次研究使用大劑量靜脈注射甲潑尼龍琥珀酸鈉(5 mg·kg-1·d-1)治療AITP，該劑量比高于常規用藥劑量，但低于沖擊治療劑量，基本與1 mg·kg-1·d-1地塞米松具有等效抗炎作用。結果發現，AITP組患兒治療效果顯著，說明靜脈給予大劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP，療效顯著。本次研究結果發現AITP患兒治療過程中未見不良反應發生，說明甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP具有較高安全性，但有研究報道，當靜脈注射15～30 mg·kg-1·d-1甲潑尼龍琥珀酸鈉沖擊治療AITP，伴有心律失常、心臟停搏甚至虛脫等嚴重不良反應[12]，與本次研究結果不一致，可能因本次用藥劑量較低，或與本次研究納入樣本數量較小有關，因此臨床中治療AITP避免采用高劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉，高劑量甲潑尼龍琥珀酸鈉一般僅用于威脅患者生命的情況。

糖皮質激素治療AITP的療效顯著，不良反應發生率低，已成為臨床中治療AITP首選藥物。關于糖皮質激素治療AITP的機制研究較多，多數學者認為糖皮質激素治療效果顯著，與其能夠減少血小板自身抗體生成有關，減少單核-巨噬細胞系統對血小板的破壞，改善毛細血管通透性有關[13]。研究發現[14-15]，健康人群外周血中有5%～15%的CD4+Tr細胞持續高表達CD25而被稱作CD4+CD25+Tr細胞，該細胞為近年發現的一種專職抑制細胞，為T細胞亞群的一種，其通過T細胞抗原受體(TCR)介導信號刺激活化后，不僅可抑制CD4+、CD8+T細胞的活化與增殖，同時能夠抑制機體免疫功能，如抑制干擾素-γ(IFN-γ)的產生，且這種抑制性不具組織相溶性復合體(MHC)限制性，能夠抑制同種同型或同種異型T細胞增殖，在移植耐受、腫瘤免疫逃逸等過程中起著重要作用，在自身免疫疾病進展中也發揮重要作用。研究發現[16-17]，在多種自身免疫性疾病中，Tr細胞的數量及功能存在不同程度異常，進一步研究證明Tr細胞參與自身免疫性疾病的發生發展。目前研究普遍認為，FoxP3基因特異且穩定地表達于胸腺及外周淋巴組織中的CD4+CD25+Tr細胞亞群中，可以作為Tr細胞的特異性標志，也是維持Tr細胞具有免疫抑制功能的必備條件，FoxP3可能是CD4+CD25+Tr細胞中主要的調節基因[18-20]。臨床中根據ITP病程是否超過1個月，將其分為AITP、CITP。本次研究采用流式細胞術檢測AITP患兒外周血中Tr細胞的數量，采用RT-PCR檢查FoxP3基因表達情況，來分析Tr細胞及FoxP3 基因在AITP發生發展中的作用，以及糖皮質激素的作用機制。

本次研究結果發現，AITP患兒外周血Tr細胞數量、FoxP3基因表達水平低于健康兒童，說明AITP患兒免疫抑制功能低，而自身體液免疫可進一步破壞血小板，進而加重AITP患兒病情，增大出血風險。研究結果發現，采用甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP患兒后，患兒外周血Tr細胞數量、FoxP3基因表達水平明顯升高，但仍低于健康兒童；結果說明Tr細胞與FoxP3基因在AITP的發生發展過程中起著一定作用，該研究的發現為研制AITP治療方法提供思路，同時為AITP的免疫治療提供臨床數據。

綜上所述，AITP患兒外周血CD4+CD25+Tr細胞數量、FoxP3表達水平明顯降低，甲潑尼龍琥珀酸鈉治療AITP效果顯著，可提高外周血CD4+CD25+Tr細胞數量及FoxP3表達水平。