蝦青素對碘海醇誘導的大鼠腎小管上皮細胞凋亡的影響

徐洋 李文華 鄭迪 張權

(1東南大學附屬徐州市中心醫院心內科，江蘇 徐州 221000；徐州醫科大學 2心血管病研究所；3附屬醫院心血管內科)

隨著冠心病的診斷、介入和放射醫學診療技術的發展，對比劑的使用日益增多。對比劑急性腎損傷(CI-AKI)逐漸成為醫源性腎衰竭的常見原因之一〔1〕。同時，CI-AKI、支架內血栓和支架術后再狹窄是患者行經皮冠狀動脈介入治療(PCI)手術后的3大并發癥〔2〕。CI-AKI的發病機制尚未完全明確,對比劑的直接腎小管細胞毒性損傷、對比劑引起氧自由基損傷和腎臟血流動力學變化是其重要機制〔3,4〕。蝦青素(AST)是一種類胡蘿卜素，有抗炎、抗氧化、調節糖脂代謝、減輕肝腎損傷等多種作用〔5〕。目前CI-AKI的研究多集中在動物水平和臨床研究，本實驗旨在體外建立CI-AKI模型，研究細胞凋亡機制在大鼠CI-AKI中的作用及AST對其凋亡的保護，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 AST(Sigma，純度>99%)，碘海醇(I，揚子江藥業有限公司)，胎牛血清(四季青，中國)，DMEM/F12(Hyclone,美國)，煙酰胺(大連美侖生物技術有限公司，中國)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒，膜聯蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)，線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1，江蘇碧云天生物技術公司)，β-actin抗體(美國Proteintech公司)，沉默信息調節因子2相關酶(SIRT)1抗體(Absin生物技術有限公司)，P53抗體(Abclonal生物技術有限公司)，Bax抗體(美國Proteintech公司)，Bcl-2抗體(美國SantaCruz公司)，CO2培養箱(Heraeus公司),三氣培養箱(Thermo 公司),酶標儀(美國伯樂公司),蛋白電泳及電轉裝置(Bio-Rad 公司)。

1.2細胞培養與分組 大鼠腎小管上皮細胞株(NRK-52E)在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養基中培養，當細胞長至80%左右時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。傳代后隨機分組：空白對照(Control)組、溶劑對照(DMSO)組(0.1% DMSO)、I組(50 g I/L)、AST預處理(AST+I)組(50 g I/L I+20 μmol/L AST)、AST預處理+SIRT1抑制劑煙酰胺(AST+I+NA)組(50 g I/L I+20 μmol/L AST+20 mmol/L NA)，I+SIRT1抑制劑(I+NA)組(50 g I/L I+20 mmol/L NA)。

1.34，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染色觀察細胞核形態 將生長于24孔培養板中的大鼠腎小管上皮細胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，4%多聚甲醛〔溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB)，pH7.4〕室溫固定15 min后，再次用PBS清洗3次×5 min，避光條件下加入3 ml DAPI(用含0.2%Triton的PBS溶解)染色5～10 min，PBS沖洗3遍×5 min。在Olympus熒光顯微鏡上，以400 nm為激發光，455 nm發射光觀察。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 用2 ml PBS輕輕潤洗培養皿中的細胞，去除PBS。將細胞重新懸浮于之前的培養基中或預冷的1×結合緩沖液中使其細胞濃度為1×106細胞/ml。取500 μl細胞懸液(5×105個細胞)至離心管中，離心1 000 r/min×5 min，去上清，加入500 μl PBS洗滌細胞，離心，去上清。再加入500 μl的1×結合緩沖液洗滌細胞，離心，去上清；加入100 μl 1×結合緩沖液重懸細胞后加入5 μl Annexin V-APC室溫避光反應15 min。加入500 μl的1×結合緩沖液洗滌細胞，離心，去上清；加入200 μl 1×結合緩沖液重懸細胞后加入5 μl PI。將樣品在1 h內用流式細胞儀檢測分析。

1.5細胞凋亡檢測試 棄去6孔板中的培養基，用PBS液洗滌3次，加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，細胞培養箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 ml JC-1染色緩沖液(5×)加入4 ml蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴。37℃孵育結束后，吸除上清，用 JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入2 ml細胞培養液，在熒光顯微鏡下觀察。檢測 JC-1單體時激發光設置為490 nm，發射光設置為530 nm；檢測 JC-1聚合物時激發光設置為525 nm，發射光設置為590 nm。

1.6Western印跡檢測蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜后室溫下封閉，用特異性抗體進行免疫雜交檢測，β-actin作為內參，化學發光劑顯色，最后對目的條帶進行掃描密度分析。每組重復3次。

1.7統計學方法 采用Graphpad Prism5.0 軟件進行方差分析、q檢驗。

2 結 果

2.1各組細胞凋亡的形態學變化 Control組與DMSO組，細胞核染色均一，未見凋亡細胞。I組可見細胞核固縮、核深染，固縮的核呈高亮狀態，部分細胞可見核裂解。與I組相比，AST+I組核固縮、核深染狀態改善，凋亡細胞減少。AST+I+NA組與AST+I組相比，固縮高亮的核增多，凋亡細胞增加。與AST+I+NA組相比，I+NA組凋亡小體進一步增加，細胞損傷加重。見圖1。

2.2各組細胞凋亡率比較 與Control組相比，DMSO組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)；I組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。AST+I組細胞凋亡率較I組顯著降低(P<0.05)。與AST+I組相比，AST+I+NA組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與AST+I+NA比較，I+NA組差異有統計學意義(P<0.05)，I組無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組JC-1熒光強度比較 DMSO組和Control組JC-1熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)，I組較Control組JC-1熒光強度顯著下降(P<0.05)。AST+I組JC-1熒光強度較 I組顯著升高(P<0.05)。與AST+I+NA組相比，AST+I組熒光強度顯著升高(P<0.05)，I+NA組JC-1熒光強度顯著降低(P<0.05)。AST+I+NA組與 I組JC-1熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。見表1，圖2。

圖1 各組細胞凋亡的形態學變化(×200)

2.4各組腎小管上皮細胞中蛋白表達變化 與Control組相比，DMSO組蛋白表達無差異(P>0.05)，I組SIRT1、Bcl-2蛋白表達顯著減少，P53、Bax表達均顯著增加(P<0.05)。AST+I組細胞SIRT1、Bcl-2蛋白表達較I組明顯增加，P53、Bax蛋白表達顯著減少(P<0.05)。AST+I+NA組與AST+I組相比，SIRT1、Bcl-2蛋白含量明顯減少，P53、Bax表達均明顯增加(P<0.05)。與AST+I+NA組相比，I+NA組SIRT1、Bcl-2蛋白表達顯著減少，Bax、P53蛋白的表達顯著增加(P<0.05)。見表1，圖3。

表1 各組細胞凋亡率和JC-1熒光強度及SIRT1、P53、Bax、Bcl-2蛋白表達比較

與Control組比較：1)P<0.05；與I組比較：2)P<0.05；與AST+I組比較：3)P<0.05；與AST+I+NA組比較：4)P<0.05

圖2 各組JC-1熒光強度比較(×200)

1～6：Control組、DMSO組、I組、AST+I組、AST+I+NA組、I+NA組圖3 Western印跡檢測各組SIRT1、P53、Bax、Bcl-2蛋白表達

3 討 論

AST是一種天然存在的紅色類胡蘿卜素衍生物,廣泛存在于多種動物及植物中。天然AST存在多種潛能,如抗氧化、抗炎、免疫調節、抑制腫瘤生長、抗衰老、預防心腦血管疾病等〔6〕。Guo等〔7〕研究表明，AST通過調節線粒體途徑促凋亡蛋白而減少腎小管細胞凋亡改善嚴重燒傷大鼠的急性腎損傷。本實驗結果證實:AST預處理可明顯減輕對比劑誘導的細胞凋亡，其腎臟保護作用與激活SIRT1，穩定線粒體膜電位，并調節凋亡相關蛋白P53、Bax、Bcl-2表達密切相關。

細胞凋亡是指細胞接受刺激信號并受基因調控的一種自主性、程序性死亡〔8〕。Bcl-2家族是線粒體途徑細胞凋亡的關鍵,以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡蛋白可通過激活一系列下游靶分子,調節線粒體膜的通透性和完整性,進而調節線粒體促凋亡因子的釋放介導細胞凋亡〔9〕。研究發現，P53可調節Bcl-2家族進而調節細胞凋亡〔10〕。P53的靶基因編碼多種促凋亡蛋白,如P53誘導基因蛋白(PIGs)、凋亡蛋白1(Fas)、凋亡酶激活因子(Apaf)-1、Bax、P53上調凋亡調節因子(PUMA)等,P53作為一種轉錄因子調控下游凋亡相關蛋白的表達,促使細胞凋亡發生〔11〕。P53也能直接結合Bak并將其激活,誘導Bak寡聚化,繼而誘導細胞色素(Cyt)c釋放最終引起細胞凋亡〔12,13〕。

SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴的第三類組蛋白去乙?；浮?4〕。SIRT1的下游效應分子包括組蛋白、P53、核因子(NF)-κB、過氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ及輔助激活因子(PGC-1α)、叉頭蛋白轉錄因子(FOXOs)、缺氧誘導因子(HIF)1等,通過將它們去乙?；_到調節糖脂代謝、抑制氧化應激和炎癥、減少凋亡、減輕衰老等生物學效應,在腫瘤、糖脂代謝穩態調節和心血管等多種疾病中發揮重要作用〔15,16〕。本實驗結果說明AST是通過激活SIRT1信號保護NRK-52E細胞，且SIRT1是在這些分子的上游發揮作用的。此外，與AST+I+NA組相比，I+NA組缺少了AST的保護，SIRT1、Bcl-2蛋白表達減少， P53、Bax表達增多，結果再次證實了AST的保護作用。

綜上所述，AST可以改善CI-AKI，其主要機制是通過激活SIRT1通路，調節線粒體膜電位，下調促凋亡蛋白P53、Bax表達，上調抗凋亡蛋白Bcl-2表達發揮抗細胞凋亡作用。AST為對比劑腎病(CIN)的防治提供了新的選擇，但AST產生腎保護性作用的具體機制尚未完全闡明，仍需進一步研究。