A型流感病毒感染雪貂造模的研究進展

馬樹杰，張博，孔宇飛，關云濤

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所獸醫生物技術國家重點實驗室， 哈爾濱 150069)

流感病毒屬于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，流感病毒屬，它是單股負鏈具有囊膜的RNA病毒。根據核蛋白(nucleoprotein，NP)和基質蛋白(matrix，M)的不同，流感病毒可以分為A、B和C三種亞型。其中A型流感病毒(influenza A virus，IAV)是一種重要的人獸共患傳染病病原，可以引起人和多種動物感染發病，對公共衛生安全具有巨大威脅。IAV根據血凝素(hemagglutinin，HA)和神經氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，又可以分為不同的亞型。目前HA可以分為18個亞型，NA可以分為11個亞型，其中H1-H16和N1-N9亞型病毒均已在水禽體內發現，而 H17N10 和 H18N11 的自然宿主是蝙蝠。IAV的基因組分為8個節段，編碼多達17種蛋白，其中必需蛋白有10種PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2，非必需蛋白主要包括PB1-F2、PB1-N40、PA-X、PA-N155、PA-N182、M42和NS3[1-6]。其中PB2、PB1、PA、NP和病毒的vRNA組裝成核糖核蛋白復合體(viral ribonucleoprotein, vRNP)，vRNP負責病毒的轉錄和復制—是IAV增殖的核心功能單位。HA和NA蛋白是IAV的兩種表面糖蛋白，HA結合細胞表面的唾液酸受體，并介導病毒囊膜與內吞體膜的融合，促進病毒的入侵。NA的神經氨酸酶活性可以切割宿主細胞和病毒表面與糖蛋白連接的唾液酸，促進子代病毒粒子釋放，阻止新生病毒粒子在細胞表面的聚集。此外，M2是病毒粒子的另一囊膜蛋白，它的質子通道活性激活后，導致病毒粒子內部酸化，促進病毒的脫衣殼。

歷史上曾發生過4次較大的流感大流行，分別為 1918 年西班牙流感(H1N1)，1957年亞洲流感(H2N2)，1968年香港流感(H3N2)和2009年的甲型流感(H1N1)。1918年的西班牙流感大流行損失慘重，至少造成 2000萬人死亡。IAV變異頻繁，當人體內缺乏中和抗體時，病毒感染人發病，嚴重的甚至導致死亡，比如H7N9亞型、H10N8亞型感染人致死事件[7-8]。新出現的IAV不僅嚴重危害了畜禽養殖業，而且對公共衛生安全具有巨大的潛在威脅。據WHO統計，H7N9 IAV自2013年爆發以來，目前已經造成1567例人感染，其中死亡615人，致死率高達39.2%[9]。2017年初，H7N9 IAV的HA堿性裂解位點插入了4個氨基酸，變成了對雞呈高致病性的H7N9 IAV[10]，造成養殖場大批雞死亡，同時2017年冬季 H7N9感染人病例激增，對公共衛生安全持續造成威脅。

IAV持續進化，新的亞型不斷出現，流感大流行隨時可能爆發，因此IAV的研究一直是病毒學領域研究的熱門。選擇合適的動物模型研究IAV致病性和傳播特性可以為病毒防控提供策略，進而為疫苗的研制提供指導方針。雪貂(Mustelaputoriusfuro)是哺乳動物，屬于鼬科，貂屬。雪貂缺乏盲腸，但有對稱的鼬科分泌麝香的肛門腺，這對腺體是潛在的防御器官，目前實驗用的大部分雪貂均通過外科手術摘除了肛門腺。雪貂飼養的適宜溫度是18 ～ 22℃，濕度是40% ～ 60%，溫度高于30℃，成年貂就表現出緊張不安，有熱虛脫的可能，因此雪貂飼養室的空氣對流和溫度均應保持在適宜水平。IAV研究中應用的雪貂需進行常見亞型如H1、H3、H5、H7和H9等流感病毒抗體的檢測，以確定實驗中使用的雪貂流感病毒抗體陰性。雪貂是研究IAV較為常用的感染模型，在IAV的致病性、傳播能力和疫苗研發方面發揮著重要作用。

1 雪貂模型概述

在IAV研究中，選擇合適的動物模型有利于科學地闡釋實驗結果，得出科學的結論。目前IAV研究中，應用較普遍的動物模型有小鼠、豚鼠、雪貂和非人靈長類動物[11-13]。不同的動物模型具有各自的優點和限制性(表1)，在選擇動物模型時需要綜合考慮。通過表1可以發現，四種動物模型具有不同的宿主特性和IAV研究的應用范圍。雪貂與非人靈長類動物二者具有相似的受體分布，感染IAV后表現相似的臨床癥狀，均是IAV研究中較為理想的研究模型。但是考慮到動物的獲得難易和飼養成本，雪貂模型比非人靈長類動物模型更具優勢，此外在感染IAV后表現的臨床癥狀方面，雪貂比小鼠和豚鼠更具優勢(表1)，且雪貂對H1、H3、H5、H7及H9等多種亞型的IAV均易感[14]，因此雪貂是IAV研究中較為常用的動物模型。

利用雪貂模型研究IAV具有許多優點：雪貂對IAV易感，病毒未經適應即可感染；雪貂上呼吸道和下呼吸道α2,6-SA(人源受體)和α2,3-SA(禽源受體)分布與人類似，可以有效模擬病毒自然狀態下IAV的感染和傳播[15](表1)，因此雪貂模型評估IAV的傳播能力應用廣泛；雪貂感染IAV后臨床癥狀與人發病相似，IAV致病性評估時雪貂常表現為發熱、厭食、體重減輕、打噴嚏、鼻腔分泌物增多、嗜睡[16-17]癥狀(表1)；雪貂體型較小，易于飼養，實驗操作簡便。雪貂模型不足之處主要有：缺乏近交系(inbred)；價格昂貴，有些實驗室很難承擔巨大的經濟費用[18]。但是綜合評估，雪貂作為動物模型優點大于缺點，因此雪貂模型在IAV的致病性、跨宿主傳播以及評估疫苗保護效力等方面應用十分廣泛。同時雪貂基因組草圖的繪制完畢，為雪貂模型的廣泛應用奠定了堅實的基礎[19]。

表1 雪貂與小鼠、豚鼠和非人靈長類動物模型在IAV研究中的比較Table 1 Comparisons of ferret models with mouse, guinea pig and non-human primate models in IAV research

2 雪貂模型在IAV致病性上的應用

不同亞型的IAV對哺乳動物的致病性不同，臨床表現從不發病到死亡不等。雪貂感染H1、H3、H6、H9后，盡管病毒可以在多個臟器內高效復制，但是雪貂發病溫和，臨床癥狀輕微，往往呈現一過性發病[20-22]。雪貂感染高致病性H5亞型禽流感病毒后，往往出現典型的流感癥狀，嚴重的出現神經系統癥狀，并最終導致雪貂死亡[14, 23]。Peng等[23]將一株人源H5N1流感病毒分離株A/Vietnam/1203/04(H5N1)感染雪貂，觀測期內雪貂出現嚴重的中樞神經系統癥狀，呈現癲癇、斜頸以及癱瘓的姿勢。病理學研究發現病毒主要感染神經元細胞，而室管膜細胞和星形膠質細胞也有零星感染，病理學變化表現為腦膜炎和腦炎。這表明高致病性H5N1流感病毒可以在雪貂中樞神經系統內高效增殖，這可能是誘發雪貂死亡的一個重要因素。人感染高致病性H5N1流感病毒的致死案例中，尸檢發現腦也出現嚴重的損傷。高致病性H5N1流感病毒除了會誘發嚴重肺損傷之外，中樞神經系統的損傷也是導致死亡的重要因素。Herfst等[24]系統研究了一株人源H5N6高致病性流感分離株(GZ/14)，該株病毒PB2蛋白627位點為賴氨酸(lysine, K)，具有很高的聚合酶活性。給雪貂鼻腔接種該病毒，接種后第3天雪貂活動性下降，被毛凌亂，眼角濕潤，平均體重下降13%，出現明顯的流感感染癥狀。病毒可以在肺、鼻甲和扁桃體等多器官復制。氣管內接種，雪貂出現重癥肺炎，接種后第2天即出現死亡。但是并非所有高致病性H5亞型流感病毒接種雪貂都出現嚴重流感癥狀。Noh等[25]將一株2.3.4.4分支的高致病性H5N6流感病毒(Md/Kr/2016)滴鼻感染雪貂，盡管可以在雪貂的鼻甲、肺和腦中低滴度復制，但雪貂沒有出現明顯的臨床癥狀，體重也未下降。與GZ/14株相比，Md/Kr/2016株病毒缺乏哺乳動物適應毒株的分子特征，這可能是其對雪貂呈現低致病性的重要原因。Pulit-Penaloza等[26]將H5N2和H5N8感染小鼠和雪貂，雖然兩株病毒均能引起小鼠嚴重發病，但是雪貂并未表現明顯臨床癥狀，無多器官感染。

IAV感染哺乳動物或人后，在宿主體內增殖，容易獲得適應哺乳動物的基因突變，突變后的病毒對哺乳動物的致病性增強[10, 22]。Li等[22]將H9N2病毒以106EID50劑量接種雪貂，第二天采集的鼻洗液測序，就發現PB2蛋白出現了E627 K或D701 N的突變，突變后的病毒對哺乳動物的致病性大大增強。2013年，中國爆發新型低致病性H7N9流感疫情，引起多人的死亡。研究表明雪貂感染H7N9流感病毒后臨床癥狀表現并不明顯，但是病毒可以在肺臟、鼻甲、氣管、扁桃體以及腦內增殖，病理學檢測發現雪貂出現嚴重的支氣管肺炎[27-28]。2017年初，低致病性H7N9流感病毒HA堿性裂解位點處插入了四個氨基酸，突變成了高致病H7N9流感病毒。不同來源的高致病H7N9流感病毒感染雪貂后，呈現出不同的的致病性[10, 29]。Shi等[10]選取CK/SD008株高致病性H7N9禽流感病毒感染雪貂，雖然病毒可以在雪貂的鼻甲、扁桃體、肺和腦內復制，但是雪貂臨床癥狀并不明顯。然而雪貂感染病毒后的第4天，剖殺取臟器后分離病毒測序，發現扁桃體、鼻甲和肺均檢測到了PB2 E627 K或D701 N的突變病毒株。將突變病毒株CK/SD008-PB2/627 K和CK/SD008-PB2/701 N突變病毒再次滴鼻感染雪貂，雪貂發病嚴重，分別于感染后第8天和第10天各死亡一只。Imai等[29]評估了一株人源高致病性H7N9分離株(GD/3)以及其NA突變株rGD/3-NA294R和 rGD/3-NA294 K，這三株病毒感染雪貂后均出現嚴重的食欲下降，昏睡臨床癥狀。病毒均可以在鼻甲、氣管、肺、腦中復制，GD/3可以在腎和小腸中復制。組織病理學檢查發現肺出現嚴重的組織損傷。感染GD/3，rGD/3-NA294R和rGD/3-NA294 K的雪貂分別于第8天，第4和第8天以及第6天各死亡1只，2只和1只。有趣的是，這些病毒并不具有經典的適應哺乳動物的分子標記PB2 627 K或701 N。PB2 588位點丙氨酸(alanine, A)到纈氨酸(valine, V)的突變可以增強病毒對哺乳動物的致病性[30]。GD/3及其NA突變株rGD/3-NA294R和 rGD/3-NA294 K的PB2 588位均為V，而CK/SD008、CK/SD008-PB2/627 K和CK/SD008-PB2/701 N的PB2 588位均為A，這可能在一定程度上解釋了GD/3及其NA突變株為什么對雪貂呈現高致病性。GD/3分離于一名使用達菲且致死的患者，其PB2 A588 V的突變很有可能是病毒在患者體內復制是獲得的。禽流感病毒在哺乳動物體內復制時獲得適應性的突變，對哺乳動物的致病性大大增強。統計數據表明，H7N9流感病毒感染人的毒株中，有83%的病毒株其PB2位點具有627 K或701N[10]。這些研究表明，雖然HA堿性裂解位點處含有多個堿性氨基酸是H5和H7高致病性流感病毒的分子特征，但是HA僅含有多個堿性氨基酸并不能一定對哺乳動物呈現高致病性，還需要多個其他基因的影響，比如PB2 588、627和701位點。利用雪貂模型，研究人員揭示了這些位點對哺乳動物致病性的影響，通過監測IAV的這些氨基酸位點，可以為IAV致病性的評估和防控提供參考。

3 雪貂模型在IAV傳播上的應用

流感病毒的傳播主要有三種形式，即接觸傳播、飛沫傳播和空氣傳播。接觸傳播主要是指易感宿主直接或間接地接觸到傳染源的感染性分泌物，導致易感宿主發??；飛沫傳播是指傳染源咳嗽、打噴嚏或說話噴射出直徑大于5 μm的小液滴，這些小液滴被易感宿主吸入到呼吸道黏膜，引起易感宿主發??；空氣傳播是指直徑小于5 μm的干燥氣溶膠，在空氣中做布朗運動，可長距離傳播，一旦被易感宿主吸入到呼吸道，即引發感染。一般利用雪貂模型研究IAV的接觸傳播和飛沫傳播能力，尤其是研究飛沫傳播能力應用最廣泛，以此來評估季節性流感和禽流感病毒的人際間流行的風險[31-32]。

IAV由結合α2,3-SA(禽源受體)受體向結合α2,6-SA(人源受體)受體的轉換通常被認為是IAV獲得人與人之間傳播能力并引發流感大流行的必要條件[15]。禽流感病毒主要結合α2,3-SA(禽源受體)受體，而人流感病毒主要結合α2,6-SA(人源受體)受體，雪貂的上呼吸道黏膜表達有大量α2,6-SA(人源受體)受體，這與人上呼吸道類似，而α2,3-SA(禽源受體)受體則主要在下呼吸道表達，因此HA的受體結合特性在一定程度上決定了IAV能否在雪貂間飛沫傳播。不同宿主IAV HA受體結合區域(receptor binding site，RBS)的氨基酸殘基都很保守，而不同亞型IAV的受體結合特性又各不相同，即便是相同亞型，不同宿主來源也存在差異[33]。Tumpey等[34]將1918 H1N1流感病毒株SC18的HA上引入D190E和D225G兩個氨基酸突變后，病毒由結合α2,6-SA受體轉變為結合α2,3-SA受體，雪貂飛沫傳播由3傳3變為3傳0，僅HA蛋白上兩個氨基酸的突變即可以使病毒在雪貂上由高效飛沫傳播變為不傳播，由此可見HA受體結合特性在飛沫傳播中的重要性。2013年中國出現的低致病性H7N9流感病毒(LPAIV H7N9)可以同時結合人源受體和禽源受體[27]，分析這些病毒的HA，發現186纈氨酸(V)和226位亮氨酸(L)是導致LPAI H7N9具備結合人源受體的關鍵氨基酸[35]。LPAIV H7N9在雪貂上的傳播能力具有毒株特異性，不同毒株在雪貂上飛沫傳播的效率也不相同[27, 36-37]。

流感病毒PB2上的E627 K和D701 N的突變也能夠促進病毒在雪貂間的飛沫傳播。Shi等[10]將分離到的高致病性H7N9流感病毒CK/SD008接種雪貂，僅在一只傳播組雪貂鼻洗液中分離到了低滴度病毒，傳播能力較低；而當接種CK/SD008-PB2/627 K毒株時，三只傳播組雪貂均分離到了病毒，高效飛沫傳播；而接種CK/SD008-PB2/701 N毒株時，兩只傳播組雪貂可以分離到病毒，另一只雪貂血清轉陽，表明三只雪貂也均發生飛沫傳播。Imai等[29]評估了一株人源高致病性H7N9分離株(GD/3)以及其NA突變株rGD/3-NA294R和 rGD/3-NA294 K在雪貂上的飛沫傳播能力，三株病毒均可以在雪貂間飛沫傳播。這三株病毒均不含PB2 627 K和701 N，但是588位點為V，有研究表明PB2 588 V是哺乳動物適應性氨基酸[30]，但是該位點是否是導致這三株病毒發生飛沫傳播的主導因素仍需進一步的實驗研究。

IAV能否發生飛沫傳播，是由病毒、宿主和環境多因素決定的。低溫和干燥可以促進IAV的飛沫傳播能力[38]，而飛沫液滴大小也對飛沫傳播具有影響。通過設計不同的實驗，控制實驗變量，可以利用雪貂模型評估不同因素對飛沫傳播的影響。雪貂評估IAV的傳播能力可以有效預測IAV在人際間的傳播潛力[32]，從而為流感大流行提供預警，為制訂防控措施提供參考。

4 雪貂模型在IAV疫苗評估方面的應用

疫苗在IAV的防控中發揮著重要的作用[39-40]，而選擇合適的動物模型來評估疫苗的安全性和免疫原性對于疫苗的研發至關重要。由于雪貂模型在IAV研究中的優異表現，因此利用雪貂模型來評估流感疫苗的免疫保護效力在疫苗研究中應該十分廣泛。

Kong等[41]構建了一株冷適應性弱毒活疫苗H7N9/AAca，該疫苗免疫雪貂后血凝抑制效價和中和效價均較高，一次免疫就可以阻止病毒在雪貂下呼吸道復制，二次免疫可以完全阻止病毒在雪貂體內復制，而一次免疫就可以阻止病毒的呼吸道飛沫傳播。Chen等[42]構建的H7N9ca疫苗株在雪貂上有良好的免疫原性，單次免疫就可以保護野生型病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9)和異源A/Netherlands/219/2003 (H7N7)的攻毒感染。Hatta 等[43]構建了一株H7N9滅活疫苗株HK125-HYPR8，肌肉注射免疫雪貂，攻毒保護實驗表明該疫苗可以阻止病毒在雪貂下呼吸道復制，并能使上呼吸道的病毒較快清除，而對照組雪貂因出現嚴重的呼吸道癥狀死亡。Wang等[44]利用轉座子誘變系統向M2基因插入了6個氨基酸，構建了一株減毒活疫苗W7-791，該疫苗免疫小鼠和雪貂后，可以對H1N1、H3N2和H5N1的攻毒提供完全保護。Rudenko等[45]評估了一株LPAI H7N9和一株HPAIV H7N9疫苗，疫苗免疫雪貂后不表現臨床癥狀，病毒學和病理學數據表明疫苗對雪貂安全性良好，一次免疫即可刺激機體產生較好的免疫原性。這些研究表明，無論是減毒活疫苗還是滅活疫苗，均可以用雪貂模型來評估其安全性和免疫原性，進而為疫苗在志愿者身上的應用提供參考，為疫苗研發提供了良好的保障。

5 結語與展望

一直以來IAV引起的流感都是對人類健康和養殖業具有嚴重威脅的人獸共患病。病毒持續進化，不斷有新的IAV亞型感染人病例的報道[7, 46-47]，嚴重威脅著人類的健康。同時高致病性H5亞型流感病毒和高致病性H7亞型流感病毒在雞群中的爆發，對社會造成了巨大的經濟損失。H9亞型流感病毒感染人病例只有零星報道[48-49]，但是H9亞型流感病毒在家禽中廣泛流行，它可以為其他亞型IAV的重組提供內部基因[50-51]，這使得其危害性不容小覷。雪貂模型由于其對不同亞型的IAV易感性強，感染IAV后表現出與人相似的臨床癥狀，呼吸道受體分布與人類似等諸多優點，在IAV研究中廣泛應用。IAV在哺乳動物體內復制時基因會發生適應性突變，利用雪貂模型評估病毒的基因突變能力和致病性，可以為病毒在人上的致病性提供預警。IAV在人際間的傳播能力受病毒、宿主和環境多種因素的影響，利用雪貂模型評估IAV的呼吸道飛沫傳播能力，為IAV可能發生的人際間傳播提供了參考。雪貂接種IAV疫苗后，產生高滴度抗體，快速清除病毒，有效保護機體。同時疫苗可以阻斷病毒在免疫后雪貂上的飛沫傳播能力。這些研究都為我們深入認識和防控IAV提供了依據，為預防流感大流行提供了堅實的保障。雪貂模型在IAV的研究中廣泛應用，但是基于雪貂模型的基礎研究仍進展緩慢。目前，雪貂全基因組的測定為進一步開展宿主方面的研究提供了保障，但是針對雪貂免疫因子的檢測試劑及相關抗體仍很難獲得，一定程度上限制了雪貂在研究IAV方面的應用。由此可見，雪貂模型距離像小鼠模型一樣成熟仍有很長的一段路要走。