芎歸六君子湯對心肌梗死大鼠G-CSF含量和VEGF、bFGF表達的影響

鄭麗莉

(山東協和學院醫學院，山東 濟南 250109)

心肌梗死(簡稱心梗)是我國目前致死率較高的疾病之一，且發病年齡呈年輕化趨勢〔1〕。梗死區內的血管再生或重新開放對心肌細胞的存活具有至關重要的作用，而單靠自然性血管新生，其過程極為緩慢，且只能代償部分心肌功能。因此，治療性血管新生即“分子搭橋術”，成為目前心梗治療的新途徑，該方法通過藥物治療促進缺血心肌微血管形成和冠狀動脈分支或側支循環的建立，能改善血供，促進心肌修復。

冠心病屬于中醫學胸痹范疇，病機主要為心陽虛兼痰濕內阻，瘀血阻絡。六君子源于《醫學正傳》，芎歸六君子湯以之為基礎，增加當歸和川芎活血補血，臨床常用于治療脾胃不足、痰瘀阻絡者。前期實驗證實，冠心病與脾胃具有相關性；芎歸六君子湯能調理脾胃運化功能，改善胃腸道激素和三磷酸腺苷(ATP)酶的水平，促進梗死心肌邊緣微血管再生，改善梗死后的心功能、血流動力學，減少梗死面積〔2〕。本研究進一步分析芎歸六君子湯對心肌梗死大鼠外周血粒細胞集落刺激因子(G-CSF)含量、心梗邊緣血管內皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)表達的影響，探討通過改善脾胃功能促進缺血心肌微血管再生的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，SPF級，購自濟南市朋悅實驗動物繁育有限公司，合格證編號SCXK(魯)20140007。

1.2實驗藥物

1.2.1中藥材 各單味中藥材由建聯藥店提供，山東中醫藥大學中藥教研室鑒定。人參、白術、茯苓、炙甘草、姜半夏、陳皮、當歸、川芎按比例3∶3∶3∶2∶2∶1∶3∶3稱取，煎煮3次后混合，60℃水浴箱濃縮，滅菌，每毫升制劑含0.63 g生藥。

1.2.2對照藥 消心痛，國藥準字H19991039，魯南貝特制藥公司提供。復方丹參滴丸，國藥準字Z10950111，天津天士力制藥公司提供。

1.3實驗器材 C201型動物呼吸機(四川成都儀器廠)；Synergy2 酶標儀 (美國伯騰儀器公司)；PE4800 PR 循環儀(美國PE公司)；鏑-型電泳儀、凝膠成分分析系統(美國Bio-拉德公司)。

1.4實驗試劑 G-CSF酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒，購自上海喬羽生物科技有限公司。兔抗-bFGF，批號BA0259；兔抗-VEGF，批號BA0407；鏈霉親合素-生物素復合物(SABC)免疫組化試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol、逆轉錄、PCR擴增試劑盒、瓊脂糖、DNA-Mark均由上海生物工程有限公司提供。

1.5方法

1.5.1動物分組及給藥方法 將大鼠60只隨機分為假手術組、模型組、消心痛組、復方丹參滴丸組和芎歸六君子湯組，每組12只。各組分別以等效劑量灌胃生理鹽水10 ml/kg、生理鹽水10 ml/kg、消心痛4.2 mg/kg、復方丹參滴丸85 mg/kg、芎歸六君子湯6.3 g/kg，1次/d，共28 d。

1.5.2模型制備 動物麻醉，固定，仰臥位，氣管插管，連接動物呼吸機，描記Ⅱ導聯心電圖。常規備皮、消毒，胸部2～3肋間偏左4～5 mm處切開，剪開心包，暴露心臟，穿線結扎冠狀動脈左前降支。線下心臟跳動減弱，顏色變白，心電圖顯示ST段弓背抬高明顯，說明結扎成功〔3〕。假手術組不結扎只穿線。術后，青霉素40萬單位肌注3 d，預防感染。

1.5.3檢測指標與方法

1.5.3.1血清G-CSF檢測 下腔靜脈取血，離心，取血清，ELISA法檢測血清G-CSF水平，具體操作參照試劑盒說明書。

1.5.3.2心梗邊緣區組織VEGF、bFGF蛋白表達的測定 取心肌組織，包括心肌梗死區、移行區、健存區，免疫組織化學法染色組織切片。兔抗鼠bFGF、VEGF多克隆抗體的工作濃度為1∶100，二氨基聯苯胺(DAB)染色，bFGF、VEGF蛋白表達以細胞內出現棕黃色顆粒沉著為陽性反應。每張切片隨機選擇5個400倍視野，采用圖像分析系統，計算梗死心肌邊緣染色陽性的OD值，取其均值即為MOD(平均光密度)。MOD與各因子蛋白表達水平呈正相關。

1.5.3.3心梗邊緣區組織VEGF、bFGF mRNA測定 取出心臟，取梗死區邊緣存活心肌50 mg，加1 ml Trizol冰上勻漿，采用Omega公司總RNA提取試劑盒進行總RNA提取。取1 μg總RNA進行逆轉錄。PCR反應體系(20 μl)∶cDNA 1 μl，10×Taq緩沖液(含 Mg2+)1.5 μl，10 mmol/L dNTP 0.2 μl，5 U/μl Taq 酶 0.2 μl，上、下游引物各0.3 μl，加DEPC水至20 μl，震蕩混勻，置PCR儀擴增。擴增條件：95℃預變性3 min；94℃變性40 s；退火；72℃延伸45 s，終末延伸10 min，循環35個。PCR引物退火溫度及產物長度見表1。1.5%瓊脂糖凝膠中進行擴增產物電泳，凝膠成像分析，掃描條帶，測定各泳道樣品光密度值，β-actin 為內參照基因，計算目標基因與β-actin光密度比值，以此值反映各樣品中VEGF及bFGF mRNA 的相對表達量。

表1 待測基因引物序列退火溫度及產物長度

1.6統計方法 運用SPSS21.0軟件，多組均數的比較行單因素方差分析，兩兩比較行最小顯著差法。

2 結 果

2.1各組G-CSF水平比較 與假手術組相比，模型組GSF含量顯著升高(P<0.01)，說明心梗后出現了自發性G-CSF增加。與模型組相比，各給藥組G-CSF水平明顯增加，其中芎歸六君子湯組效果最好(P<0.01)。見表2。

2.2各組心梗邊緣區VEGF、bFGF蛋白表達比較 與假手術組相比，模型組VEGF、bFGF蛋白表達明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組VEGF、bFGF升高顯著(P<0.01)，且以芎歸六君子湯組升高最顯著 (P<0.01)。見表2。

2.3各組心梗邊緣區VEGF、bFGF mRNA表達比較 與假手術組相比，模型組VEGF、bFGF mRNA表達顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，各用藥組VEGF、bFGF mRNA含量顯著升高(P<0.01)，且以芎歸六君子湯組升高最明顯，與其他給藥組相比有顯著性差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組血清G-CSF水平和心梗邊緣組織VEGF、bFGF蛋白及mRNA表達比較

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與消心痛組比較:3)P<0.01；與復方丹參滴丸組比較:4)P<0.01

3 討 論

心梗是冠狀動脈閉塞，血流中斷，部分心肌因嚴重的持久性缺血而發生局部壞死。心梗后引起的炎癥反應，可動員造血干細胞、內皮祖細胞(EPC)和間充質細胞等少量骨髓干細胞進入血液循環，并向梗死區和血管損傷處遷移，一則抑制淋巴細胞增殖活化，從而抑制免疫炎癥反應；二則分化成為心肌細胞和血管內皮細胞，促進心肌細胞和新生血管的形成，使梗死心肌的結構和功能得到修復。細胞因子G-CSF、VEGF、bFGF等均能動員進入外周血和受損組織。G-CSF可調節宿主心肌細胞的微環境和自分泌，上調缺血心肌血管活性生長因子如 VEGF的表達，不僅能使外周血中EPC和造血干細胞的數量顯著增加，還可以動員其遷移至損傷心肌，并分化為血管內皮細胞，促進血管新生，增加側支循環〔4〕。G-CSF可以上調心肌梗死區凋亡抑制基因Bc1-2表達，抑制凋亡誘導基因如P53和FasL的表達，從而抑制心肌細胞凋亡，修復心肌細胞，改善心梗后心臟功能〔5〕。

心梗后會引起缺血心肌的自發性微血管新生。自發性血管新生耗時長，數量少，難以建立有效的側支循環。治療性血管再生可促進冠脈側支循環的建立和開放，為缺血心肌提供血供，減少心肌細胞的壞死和凋亡，有效改善心功能，因此成為心梗治療的研究熱點。血管新生是一個復雜的高度受控的過程，血管內皮細胞的增殖、遷移是基礎性環節，多種內皮細胞生長因子參與其中。VEGF、bFGF為體內最有效的促血管因子，可促進血管新生、側支循環形成及心肌細胞再生。VEGF 與其受體(VEGFR)-1結合，在核酸和蛋白水平誘導纖溶酶原激活物的表達，降解細胞外蛋白和基膜，增加血管內皮細胞通透性，蛋白外滲，加快內皮細胞的增殖和遷移，為血管新生提供基質支撐〔6〕。VEGF 與其受體VEGFR-2結合后，激活絲裂原活化的蛋白激酶，引起受體自身磷酸化，實現 VEGF 的絲裂原特性，誘導血管內皮細胞的有絲分裂，促進新生血管生成〔7〕。心肌在缺血狀態下能夠分泌bFGF，刺激血管內皮細胞產生膠原酶和纖溶酶原激活物，降解基底膜，誘導毛細血管內皮細胞形成管腔樣結構；同時，bFGF受體RNA合成增加，受體數目上調，使bFGF的作用進一步加強〔8〕。與VEGF不同的是，bFGF對微血管側支和動脈性側支的生長都有促進作用〔9〕。

本研究結果顯示，芎歸六君子湯組能顯著提高外周血G-CSF含量，改善梗死心肌邊緣VEGF和bFGF的蛋白和基因表達，說明芎歸六君子湯能促進心梗大鼠微血管新生，改善心功能，其機制可能為：促進G-CSF分泌，動員骨髓干細胞向梗死灶遷移和分化；增加促血管因子VEGF、bFGF分泌，促進血管內皮細胞的增殖、趨化和遷移。

心梗屬于中醫學“胸痹”范疇，其病機以氣虛為本，痰凝瘀阻為標。芎歸六君子湯以四君子湯配伍川芎、當歸而成。脾胃為后天之本，氣血生化之源，心之氣血稟受于中焦脾胃。四君子湯具有補氣健脾之效，脾胃健運，氣血化生有源，能增加心肌血供；加味半夏、陳皮化痰消脂，改善血管硬化、脂質沉積；加味川芎、當歸補血活血，既能祛瘀行滯，改善血管淤滯，又可促血化生，改善心肌缺血。八藥合參，共奏補氣健脾、化痰活血之效，能有效改善心?；颊叩难河贉?、血供不足問題，與實驗結果相吻合。本研究結果同時提示改善脾胃功能有助于改善心肌缺血，說明脾胃和心臟可能存在一定的相關性。關于芎歸六君子湯對G-CSF和促血管因子的影響，是否同時存在對下游信號通路如胞內磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)的影響，及各靶點之間是否存在相互作用，有待下一步研究予以闡釋。