纖維素酶結合堿性蛋白酶提高冷榨大豆出油率的工藝優化

朱秀清，曾劍華，房媛媛，石彥國

(1.哈爾濱商業大學 食品工程學院，黑龍江省普通高校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江省谷物食品與綜合加工重點實驗室，哈爾濱 150076； 2.黑龍江省綠色食品科學研究院，哈爾濱150028；3.東北農業大學 食品學院，哈爾濱150030)

大豆油制取方法有浸出法，壓榨法，水酶法等。浸出法出油率高，但存在溶劑殘留等問題[1]。水酶法制取大豆油，出油率達80%～90%，但水酶法工藝會產生大量“高營養”污水，而且其破乳問題也一直未有很好的解決措施，因此一定程度上限制了水酶法制油的推廣[2]。傳統熱榨法出油率低、損耗大，且溫度高造成豆粕質量差[3]。冷榨過程不涉及高溫和化學處理，能最大限度減少對食品營養成分和功效因子的破壞[4-6]。但冷榨出油率偏低，工業化生產效益低，因而在冷榨技術基礎上加入酶作用以期提高出油率[7]。

本文以大豆為原料，加入纖維素酶與堿性蛋白酶冷榨大豆，以大豆出油率為評價指標，通過單因素試驗和正交試驗研究復合酶提高冷榨大豆出油率的最佳工藝參數，并對復合酶法冷榨大豆油品質進行分析，以期為提高大豆出油率和開發更營養健康的大豆油提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大豆(水分11.5%±0.5%、脂肪18.5%±0.5%)，市售。纖維素酶(酶活力15 966 U/g)，國藥集團化學試劑有限公司；堿性蛋白酶(酶活力166 824 U/g)，北京奧博星生物技術有限公司；牛血清蛋白，天津市科密歐化學試劑開發中心；二鉀酚橙，磷酸，甲醇，冰乙酸，乙二胺四乙酸二鈉，多聚磷酸鈉，對苯二酚。

旋風磨盤粉碎機，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計，TD5A-WS臺式低速離心機，電熱恒溫水浴鍋，電子天平，德國科美特K60V/I冷榨榨油機。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理及冷榨制油

挑選無霉變的大豆粉碎過篩，并保存在干燥陰涼處備用；纖維素酶和堿性蛋白酶溶解于蒸餾水中，在45℃保溫放置30 min進行預活化，并測定酶活力備用[8]。取粉碎一定粒徑的大豆粉500 g與一定量預活化酶液混合均勻，在設定的溫度和轉速下進行冷榨；將得到的毛油在6 000 r/min、 20℃條件下離心20 min去雜質后，按下式計算大豆出油率。

出油率=毛油含量/(物料質量×油脂含量)×100%

1.2.2 理化指標測定

1.2.2.1 大豆理化指標測定

水分的測定：GB/T 14489.1—2008。脂肪的測定：GB 5009.6—2016。

1.2.2.2 大豆油理化指標測定

水分及揮發物測定：GB 5009.236—2016。不溶性雜質含量的測定：GB/T 1535—2017。

1.2.3 酶活測定

堿性蛋白酶酶活測定參照SB/T 10317—1999福林-酚法。纖維素酶酶活測定參照孫盈等[9]的方法。

1.2.4 數據統計分析

每個樣品做3次平行取平均值，采用SPSS 17.0和 Origin 8.0對原始數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 物料粒徑對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取脫皮粉碎后的大豆粉過10、20、30、40、60、80目標準篩得到不同粒徑大豆粉500 g(水分11%)，入榨前加入預活化350 U/g堿性蛋白酶液混合均勻后，在冷榨溫度85℃、螺桿轉速34 r/min條件下，考察物料粒徑對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖1。

圖1 物料粒徑對酶法冷榨大豆出油率的影響

由圖1可知，酶法冷榨大豆出油率隨物料粒徑的減小先快速增大后緩慢增大，當標準篩目數超過40目后大豆出油率增加速率緩慢。當物料的顆粒較大時，物料與酶相互接觸的表面積相對較小，酶與底物的反應速率下降，導致出油率降低；而物料粒徑較小時，有利于酶與物料充分反應，提高大豆出油率[10]?；诠I生產成本以及能耗的影響，物料粒徑選擇40目為宜，此時大豆出油率為47.63%。

2.1.2 物料水分含量對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取40目大豆粉500 g，入榨前加入預活化350 U/g堿性蛋白酶液混合均勻后，在冷榨溫度85℃、螺桿轉速34 r/min條件下，考察物料水分含量對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖2。

圖2 物料水分含量對酶法冷榨大豆出油率的影響

由圖2可知，隨著大豆水分含量的增加，大豆出油率先增大后下降，當大豆水分含量達到13%時，出油率最高，為47.53%。在冷榨時物料水分含量的多少對油料的出油率有顯著影響，油料的彈性、塑性、導熱性、機械強度、組織結構等物理性質會因物料中的水分而受到影響，伴隨著物料水分含量的增加，其可塑性也會隨之增大。另一方面，如果物料水分含量過低，可塑性會降低，物料粒子的結合就會松散，均不利于油的榨出[11-12]。因此，物料水分含量選擇13%為宜。

2.1.3 纖維素酶與堿性蛋白酶添加量對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取40目大豆粉500 g，調節水分含量為13%，入榨前加入相同體積不同酶活的纖維素酶液(堿性蛋白酶液)，在冷榨溫度85℃、螺桿轉速34 r/min條件下，考察纖維素酶、堿性蛋白酶添加量對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖3。

圖3 纖維素酶與堿性蛋白酶添加量對酶法 冷榨大豆出油率的影響

由圖3可知，隨著纖維素酶(堿性蛋白酶)添加量的增加，大豆出油率逐步增大并趨于平緩。由圖3a可知，纖維素酶添加量為15 U/g時，大豆出油率達到最大值，為44.92%。由圖3b可知，堿性蛋白酶添加量為350 U/g 時,大豆出油率達到最大值，為43.92%。纖維素酶能破壞大豆細胞壁促進油脂流出，堿性蛋白酶能水解脂蛋白復合體、脂多糖等組織結構，從而使以游離態存在的油脂增多，有利于冷榨過程中大豆出油率的提高[13]；當纖維素酶和堿性蛋白酶的添加量達到一定程度后，酶與底物的作用達到飽和，且冷榨過程中酶與大豆粉作用時間短，同時單一酶解對油的溶出率影響是有限的，因此再增加酶添加量對大豆出油率的增加不明顯。因此，纖維素酶添加量選擇15 U/g為宜，因堿性蛋白酶添加量為250 U/g的出油率與350 U/g的出油率沒有顯著差異(p>0.05)，基于生產成本考慮堿性蛋白酶添加量選擇250 U/g為宜。

2.1.4 復合酶配比對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取40目大豆粉500 g，調節水分含量為13%，入榨前選2.1.3最佳纖維素酶與堿性蛋白酶添加量按體積比分別加入纖維素酶液與堿性蛋白酶液混合均勻，在冷榨溫度85℃、螺桿轉速34 r/min條件下，考察復合酶配比對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖4。

圖4 復合酶配比對酶法冷榨大豆出油率的影響

由圖4可知，復合酶冷榨大豆出油率顯著高于(p<0.05)單一酶的作用，隨著纖維素酶含量的增加，大豆出油率先增大后緩慢減小，當復合酶(纖維素酶與堿性蛋白酶)配比為1∶2時大豆出油率最高，為57.25%。

2.1.5 復合酶用量對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取40目大豆粉500 g，調節水分含量為13%，入榨前加入纖維素酶液與堿性蛋白酶液(配比1∶2)混合均勻，在冷榨溫度85℃、螺桿轉速34 r/min 條件下，考察復合酶用量對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖5。

圖5 復合酶用量對酶法冷榨大豆出油率的影響

由圖5可知，隨著復合酶用量的增加，大豆出油率先增加后減少，當復合酶用量為0.2%時，大豆出油率最高，為58.05%。在纖維素酶和堿性蛋白酶協同作用下，大豆細胞壁被破壞及脂蛋白等復合體的水解促進了中性脂肪的游離并流出[14]，從而提高大豆的出油率；但是當復合酶與底物作用達到飽和時，繼續增加復合酶用量，大豆出油率不再提高。因0.15%與0.2%的復合酶用量對大豆出油率沒有顯著差異，從節約成本角度出發復合酶用量選擇0.15%為宜。

2.1.6 冷榨溫度對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取40目大豆粉500 g，調節水分含量為13%，入榨前加入纖維素酶液與堿性蛋白酶液(配比1∶2)混合均勻，在復合酶用量0.15%、螺桿轉速34 r/min條件下，考察冷榨溫度對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖6。

圖6 冷榨溫度對酶法冷榨大豆出油率的影響

由圖6可知，隨著冷榨溫度的逐漸升高，大豆出油率先上升后緩慢上升。因為高溫下纖維素酶和堿性蛋白酶基本失活[15]，所以溫度不斷升高大豆出油率出現先升高后緩慢上升趨勢。因80、85℃和90℃條件下大豆出油率無顯著差異(p>0.05)，因此冷榨溫度選擇80℃為宜，此時出油率為58.45%。

2.1.7 螺桿轉速對酶法冷榨大豆出油率的影響

稱取40目大豆粉500 g，調節水分含量為13%，入榨前加入纖維素酶液與堿性蛋白酶液(配比1∶2)混合均勻，在復合酶用量0.15%、冷榨溫度80℃條件下，考察螺桿轉速對酶法冷榨大豆出油率的影響，結果見圖7。

圖7 螺桿轉速對酶法冷榨大豆出油率的影響

由圖7可知，隨著冷榨機螺桿轉速的增加，大豆出油率先上升后下降，當螺桿轉速為36 r/min時大豆出油率達到最大，為58.96%。這是因為冷榨機腔膛內的螺桿對物料具有剪切作用，物料因為螺桿的剪切使得其內部組織被破壞，內容物就會充分游離擠出，但當冷榨機的螺桿轉速過高時，物料在腔膛內的橫向運動也隨之加快，大豆物料和螺桿相對摩擦不夠充分，擠壓時間過短，導致出油率下降，而且還容易造成堵機的現象[16]。因此，螺桿轉速選擇36 r/min為宜。

2.2 復合酶冷榨大豆油工藝優化

通過單因素試驗結果分析，稱取40目大豆粉500 g，調節水分含量為13%，纖維素酶液與堿性蛋白酶液配比1∶2，選取復合酶用量、冷榨溫度和螺桿轉速進行L9(33)正交試驗。正交試驗因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計及結果

表3 正交試驗方差分析

由表2可知，各因素對復合酶冷榨大豆出油率的影響大小為A>B>C，即復合酶用量>冷榨溫度>螺桿轉速，所得到的最優組合為A2B2C2，即復合酶用量0.2%、冷榨溫度80℃、螺旋桿轉速36 r/min。在最優條件下進行驗證試驗，復合酶冷榨大豆出油率為70.6%。由表3可知，復合酶用量、冷榨溫度和螺桿轉速對酶法冷榨大豆出油率有極顯著(p<0.01，R2=0.975 2)影響，該結論與極差分析結果一致。

2.3 復合酶冷榨大豆油品質

2.3.1 復合酶冷榨大豆出油率(見圖8)

圖8 復合酶冷榨大豆與常規冷榨大豆出油率比較

由圖8可知，復合酶冷榨大豆在最佳工藝條件下所得大豆出油率為70.6%，優于常規冷榨(未經酶處理)工藝條件下大豆出油率(68.5%)，出油率提高了2.1個百分點。

2.3.2 復合酶冷榨大豆油質量

復合酶冷榨大豆油質量指標見表4。由表4可知，復合酶冷榨大豆油的色澤比較深，呈棕紅色，且澄清、無雜質，具有大豆油特有的香氣與風味。復合酶冷榨大豆油的各項指標基本符合GB/T 1535—2017三級大豆油的標準。

表4 復合酶冷榨大豆油質量指標

3 結 論

通過單因素試驗和正交試驗研究纖維素酶與堿性蛋白酶提高冷榨大豆出油率的工藝條件。得到復合酶冷榨大豆油的最佳工藝參數為：物料粒徑40目，水分含量13%，冷榨溫度80℃，螺桿轉速36 r/min，復合酶(纖維素酶液與堿性蛋白酶液體積比1∶2)用量0.2%。在最佳工藝條件下大豆出油率為70.6%，優于未經酶處理的最佳冷榨工藝的大豆出油率(68.5%)，出油率提高了2.1個百分點。經復合酶冷榨所得大豆油具有大豆油特有的氣味和滋味，呈棕紅色，且澄清、無雜質，不存在溶劑殘留問題。