板芪口服液定性與定量方法的研究

董蒨蒨，孫耀貴，孫 娜，尹 偉，范闊海，李宏全

(山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801)

板芪口服液是由黃芩、黃芪、丹參、連翹等藥材提取的中藥復方制劑，具有扶正祛邪，補氣升陽，清熱解毒，消腫散結的功效。臨床上主要治療豬病毒性心肌炎引起的發熱、精神沉郁、減食或停食，蹄部皮膚開裂出血、蹄殼變形或脫落[1-2]等問題。目前中藥制劑作為藥物或飼料添加劑治療動物疾病具有毒副作用小、不易產生耐藥性和綠色安全等優點[3]。所以，建立完善的中藥質量標準有利于形成自主創新的新獸藥研究開發體系，更利于中獸藥產業的迅速發展。為了有效控制中獸藥質量標準，研究參考相關文獻與實驗室已有的質量控制方法，建立了定性鑒別黃芪、丹參、黃芩、連翹的薄層色譜方法與定量測定有效成分黃芩苷的HPLC法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Agilent1260高效液相色譜儀(Agilent公司)；薄層色譜儀(CAMAG公司)；電子分析天平(賽多利斯公司)；SB25-12D超聲清洗機(Scientz公司)。

1.2 試藥 黃芩苷對照品(批號110715-201720)、黃芩素(批號111595-200905)、黃芩對照藥材(批號120955-201309)、黃芪甲苷對照品(批號110781-201515)、黃芪對照藥材(批號120974-201311)、連翹苷對照品(批號110821-201615)、連翹對照藥材(批號120908-201216)、丹參酮ⅡA(批號110766-200619)、丹參對照藥材(批號120923-201625)購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純(Merck公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。板芪口服液由黃芪、黃芩、丹參、連翹、板藍根、蒲公英藥材分二次煎煮，合并煎煮液濾過，濃縮至要求密度后醇沉濾過、回收乙醇，配液、灌封。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 黃芪TLC鑒別 取本品10 mL，水飽和的正丁醇溶液振搖提取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次10 mL，再用正丁醇飽和的水溶液洗滌2次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方比例，取除黃芪外的其他藥材，同法制成陰性對照溶液。1 g黃芪對照藥材加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL溶解，同法制備作為黃芪對照藥材溶液。對照品：1 mg/mL黃芪甲苷溶液。吸取上述對照品、對照藥材溶液各5 μL，供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL點于同一G板上，以氯仿∶甲醇∶水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別置紫外燈(365 nm)和日光下檢視。結果如圖1-A(365 nm)、1-B(日光)，供試品在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上顯相同的橙紅色斑點(365 nm)、紅色斑點(日光)，缺黃芪陰性對照在相同斑點處未見干擾。

2.1.2 連翹TLC鑒別 取本品10 mL加氯仿提取兩次，每次10 mL，合并氯仿，蒸干，加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。按處方比例, 取除連翹外的其他藥材, 同法制成陰性對照溶液。1 g連翹對照藥材加水50 mL，超聲30 min，過濾，濾液同法制備作為連翹對照藥材溶液[4]。對照品：0.25 mg/mL連翹苷對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL點于同一G板上，以氯仿∶甲醇(8∶1)為展開劑，展開，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于日光下檢視。結果如圖2，供試品在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上顯相同的褐色斑點，缺連翹陰性對照在相同斑點處未見干擾。

1:對照品(control);2:對照藥材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液樣品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:陰性對照(negative control)圖1 黃芪薄層色譜圖方法驗證Fig 1 Verification of the method of TLC of Astragali radix

1:對照品(control);2:對照藥材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液樣品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:陰性對照(negative control)圖2 連翹薄層色譜圖方法驗證Fig 2 Verification of the method of TLC of forsythia suspensa

2.1.3 黃芩TLC鑒別 取本品10 mL加乙酸乙酯提取三次，每次10 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。按處方比例, 取除黃芩外的其他藥材, 同法制成陰性對照溶液。1 g黃芩對照藥材加乙酸乙酯∶甲醇(3∶1)30 mL超聲30 min，過濾，濾液蒸干，殘渣加甲醇5 mL溶解作為黃芩對照藥材溶液。對照品：1 mg/mL黃芩素對照品溶液。吸取上述對照品、對照藥材溶液各5 μL，供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL點于同一默克板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(10∶3∶1∶2)為展開劑，預飽和30 min，展開，晾干，置于日光下檢視。如圖3結果顯示供試品在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上顯相同的黃色斑點，缺黃芩陰性對照在相同斑點處未見干擾。

1:對照品(control);2:對照藥材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液樣品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:陰性對照(negative control)圖3 黃芩薄層色譜圖方法驗證Fig 3 Verification of the method of TLC of Scutellariae radix

2.1.4 丹參TLC鑒別 取本品10mL用水飽和的正丁醇溶液振搖提取2次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次10 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。按處方比例,取除丹參外的其他藥材,同法制成陰性對照溶液。1 g丹參對照藥材加入5 mL乙醇，超聲15 min，離心10 min，取上清作為對照藥材溶液。對照品：0.5 mg/mL丹參酮ⅡA對照品溶液。吸取上述對照品、對照藥材溶液5 μL，供試品溶液、陰性對照溶液各10 μL點于同一默克板上，用氯仿∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(6∶4∶8∶1∶4)作為展開劑展開，晾干，在365 nm下檢視。結果如圖4，供試品在與對照品、對照藥材色譜相應的位置上顯相同的藍色斑點，缺丹參陰性對照在相同斑點處未見干擾。

1:對照品(control); 2:對照藥材(control medicinal material);3-5:三批板芪口服液樣品(Three batches of Banqi oral liquid samples);6:陰性對照(negative control)圖4 丹參薄層色譜圖方法驗證Fig 4 Verification of the method of TLC of Salvia miltiorrhiza

2.2 黃芩苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)，流速：1 mL/min，檢測波長：280 nm，柱溫：25 ℃，進樣量：10 μL，以黃芩苷計理論塔板數不低于2500。

2.2.2 樣品溶液的制備 對照品制備：精密稱定黃芩苷對照品12.25 mg，加甲醇稀釋制成61.25 μg/mL的對照品溶液。

供試品制備：精密量取板芪口服液5 mL于100 mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續濾液1 mL加甲醇至10 mL，即得。

陰性對照制備：除黃芩藥材外其余按處方比例根據板芪口服液工藝制得的樣品，按供試品制備方法制備，即得。

2.2.3 系統適應性實驗 取上述溶液各10 μL進樣，記錄HPLC色譜圖，如圖5，黃芩苷對照品出峰時間為12.5分左右，供試品溶液在相同時段目標峰與其他峰分離度均大于1.5，基線平穩；缺黃芩的陰性溶液在12.5分左右基線平穩，無干擾峰出現，表明黃芩苷的測定方法適用于板芪口服液的含量測定。

圖5 黃芩苷對照品(A)、樣品(B)、陰性對照(C)HPLC色譜圖Fig 5 HPLC chromatogram of Baicalin control (A), sample (B) and negative control (C)

2.2.4 線性范圍考察 取黃芩苷對照品溶液(382.8 μg/mL)加甲醇稀釋至不同濃度進行進樣，得回歸方程y=3021.3x-31.634，R2=0.9999，結果表明黃芩苷標準品的進樣量在0.1531～1.225 L之間線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 黃芩苷對照品溶液重復進樣6次，記錄峰面積，結果可得黃芩苷峰面積的RSD值為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 制備6份供試品溶液進行進樣，記錄峰面積，結果樣品中黃芩苷的含量為2.736 mg/g，RSD值為1.88%，表明實驗方法的重復性好。

2.2.7 穩定性實驗 取一份供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，結果6次測定的RSD值為0.86%，表明樣品在24 h內有良好的穩定性。

2.2.8 加樣回收率 精密稱取已知含量1.370 mg/mL的樣品18份, 每份1 mL置于25 mL容量瓶中, 精密加入低中高濃度(分別為0.451、0.975、1.421 mg/mL)的黃芩苷對照品溶液1 mL，按板芪口服液供試品制備, 進樣10 μL, 測定峰面積，計算加樣回收率。結果得加樣回收率分別為96.99%、98.06%、98.96%，RSD值分別為2.02%、1.81%、1.29%。

2.2.9 含量測定 取三批板芪口服液，按上述方法測得黃芩苷的平均含量為2.71 mg/mL，RSD值為2.94%。

3 討論與結論

通過對黃芪、連翹、黃芩和丹參的TLC鑒別作為板芪口服液的定性鑒別。其中黃芪的TLC鑒別方法參考了本實驗室前期黃芪鑒別的方法，結果發現用正丁醇飽和水溶液洗滌后的條帶更加清晰，雜質更少，所以選擇此方法。連翹的TLC鑒別中，在365 nm下顏色較暗，不易觀察。日光下斑點顏色明亮，易于觀察。所以選擇在日光下檢視。

黃芩的TLC鑒別中，參照文獻采用了不同提取溶劑包括水飽和正丁醇、氯仿、乙酸乙酯等，以及不同的展開條件進行試驗。其中水飽和正丁醇作為提取溶劑效果最好。在使用GF254板與聚酰胺薄膜[5]，展開劑為甲苯∶丙酮∶冰醋酸∶甲酸(8∶1∶1∶1)[6]的試驗中，由于對應斑點不圓整未采用。參照《中國獸藥典》[7]中雙黃連口服液的質量標準使用聚酰胺薄膜。兩種展開劑分別為甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(10∶3∶1∶2)[8]與乙酸[9]，結果顯示斑點的分離度均不好，未采用。參照陸靜嫻等人的研究，使用青島海洋G板，兩種展開方法分別為氯仿∶甲醇(9∶1)晾干后噴以2%三氯化鐵乙醇溶液[10]和乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶水(5∶3∶1∶1)[11]，結果由于對照品的斑點不清晰未采用。最后使用默克板得到清晰完整的斑點，所以選擇此方法。之前選擇的對照品為黃芩苷，但由于在所有方法中黃芩苷的斑點的RF值小于0.2，所以采用黃芩素作為對照品。

丹參的TLC鑒別中，采用不同方法處理樣品，其中用水飽和的正丁醇溶液提取、氨試劑洗滌效果最好。在兩種展開劑氯仿∶甲苯∶乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸(6∶4∶8∶1∶4)與先用此展開劑展至4 cm再用石油醚(60-90)∶乙酸乙酯(4∶1)展至8 cm下采用青島海洋G板、GF254板[12]，默克板進行展片，結果顯示默克薄層板在前者展開劑的斑點最圓整且分離度好，所以采用此方法。另外還參照文獻采用了聚酰胺薄膜，展開劑為丙酮∶36%乙酸∶氨水(10∶25∶1)，晾干后用氨熏蒸5 min[13]，此方法條帶清晰，但斑點不清晰，所以沒有采用。

板芪口服液的含量測定最初選擇黃芪甲苷、連翹苷、丹酚酸B與黃芩苷為指標成分，但由于試驗中還涉及了板芪口服液的工藝研究，前三種指標成分含量過低，誤差大，而黃芩苷的含量高，更具有統計學意義，所以選擇黃芩苷為含量測定的指標成分。黃芩苷的含量測定參照《中國獸藥典》中黃芩藥材的含量測定方法，樣品與黃芩苷對照品對應的峰分離度好，基線平穩，可作為含量測定的定性方法。

板芪口服液的薄層色譜鑒定方法與高效液相色譜含量測定方法的研究為板芪口服液的質量標準奠定了基礎，為后期新獸藥的申報提供了數據支持。