性類固醇激素在蝦夷扇貝性腺發育周期的分布?

謝欣冉， 張玲玲，2??， 孫紅振， 張 陽， 李婉茹， 張美溦， 包振民，2

(1．中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003;2．海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室，青島海洋科學與技術國家實驗室，山東 青島 266237)

類固醇(Steroids)是一種含有甾核的化合物，是以膽固醇(Cholesterol)為前體經過一系列酶促反應合成而來，一般作為激素在生物性別分化、生殖、發育以及內穩態維持等多種生理過程中發揮重要作用[1]。在脊椎動物中，與生殖調控相關的性類固醇激素主要包括孕酮、睪酮和雌二醇。已有研究顯示，這三種激素在軟體動物中也存在[2-3]，而且軟體動物性腺中性類固醇激素含量會隨生殖周期發生季節性變化[4-5]。因此，性類固醇激素很可能參與軟體動物的生殖調控。

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是一種沿日本北部海岸線，朝鮮半島北部和俄羅斯遠東地區自然分布的雙殼貝類。由于其具有較高的商業價值，自1982年從日本引進以來，蝦夷扇貝已成為中國北方地區最重要的海水養殖貝類之一[6]。由于蝦夷扇貝在水產養殖中的重要性，對其性腺發育、繁殖規律的研究起步較早[7-8]，已有研究者在蝦夷扇貝性腺中檢測到了雌激素，以及脊椎動物激素合成通路基因的活性[9-10]。但迄今為止，尚缺乏對蝦夷扇貝性腺發育周期中多種性類固醇激素含量的系統研究。本文分析了蝦夷扇貝性腺4個發育階段中3種常見性類固醇激素(孕酮、睪酮和雌二醇)含量及相對比例的變化，為研究性類固醇激素在軟體動物生殖、發育過程中的作用提供了參考。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

實驗用二齡蝦夷扇貝均取自山東省萊州市海益養殖廠。樣品從2015年8月采集至次年7月，每次取樣約100只。將采集的蝦夷扇貝運回實驗室置于過濾海水中暫養24 h，每次挑選40個活力良好的個體(雌雄各20個)，將性腺剪為2部分，一部分用4%多聚甲醛固定24 h，后經換液保存于100%甲醇中，用于石蠟切片統計性腺發育時期的周年分布頻率；剩余的性腺組織去除消化管后液氮快速冷凍，然后保存于-80 ℃，用于激素測定。

1.2 組織學觀察

將多聚甲醛固定后的性腺樣品從甲醇中取出，進行常規石蠟切片，并使用蘇木精-伊紅(HE)進行染色。簡要流程如下：使用梯度乙醇脫水(70%、85%、95%乙醇3 min，無水乙醇5 min，2次)，二甲苯透明(15 min，2次)，石蠟包埋，石蠟切片(切片厚度為5 μm)，切片完全展開后貼于載玻片上，在烤片機中烘干(37 ℃，3 h以上)；使用二甲苯將切片脫蠟，梯度乙醇復水(100%、90%、85%、70%、50%、30%乙醇各3 min)，使用蘇木精染液染色5～10 min，自來水沖洗掉多余染液，酸水(0.5% HCl 溶液)分色，自來水沖洗 20～30 min復藍；然后使用梯度乙醇脫水(30%、50%、70%、85%、95%乙醇各3 min)，在伊紅染液(1%伊紅溶于95%乙醇溶液)中染色10～15 s，95%乙醇洗去多余染液，無水乙醇脫水(5 min, 2次)，二甲苯透明，中性樹膠封片；使用顯微鏡觀察切片并拍照。

1.3 性類固醇激素水平檢測

1.3.1 性類固醇激素的提取 每個性腺發育時期選取6個樣品(精巢、卵巢各3個)，采用二氯甲烷液液萃取法進行激素提取。取0.1 g性腺組織，用預冷的0.5 mL超純水勻漿2次，每次2 min；使用超聲波細胞破碎儀將組織勻漿破碎(200 w，超聲10 s，暫停5 s，共3 min)；加入400 μL預熱的25 mmol/L的HCl，渦旋2 min并于40 ℃水浴孵育15 min；孵育結束后，加入1.25 mL 0.07 mol/L的Na2HPO4，向勻漿液中加入14 mL二氯甲烷，渦旋2 min后將勻漿液于3 000g離心10 min，使水與有機相分離；使用巴斯德管將下層有機相轉移到50 mL離心管中；向殘留有上層無機相的離心管中再次加入14 mL二氯甲烷并渦旋2 min，之后3 000g離心10 min，使用巴斯德管將下層有機相轉移到50 mL離心管中；使用氮吹儀在室溫將有機相中二氯甲烷吹干獲得的固態殘留物使用500 μL ELISA試劑盒中的EIA buffer溶解。

1.3.2 性腺性類固醇激素水平的測定 使用Cayman公司的酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒測定卵巢和精巢中孕酮、睪酮和雌二醇的濃度，流程參照Cayman ELISA試劑盒中的說明書。每個樣品設2個技術重復，使用Cayman公司提供的ELISA Double表格計算樣品中的激素濃度。類固醇含量定義為每克性腺濕重的類固醇量(ng/g)。

1.4 數據統計分析

蝦夷扇貝不同時期性腺激素的差異顯著性采用單因素方差分析法(one-way ANOVA)分析；同一時期卵巢和精巢中性類固醇激素的差異顯著性使用獨立樣本t檢驗分析；3種激素含量之間的關系通過Pearson相關分析法獲得。顯著性水平均設定為P<0.05。以上分析均使用SPSS 21.0軟件計算。

2 結果與分析

2.1 性腺發育的周年分布

本研究通過組織學方法分析蝦夷扇貝性腺4個主要發育階段(休止期、增殖期、生長期、成熟期)的周年分布，統計結果見圖1。休止期主要分布在7—9月，增殖期分布在10—12月，生長期主要分布在1—2月，成熟期主要分布在1—6月。有些月份性腺發育同步，比如8—9月份的精巢和卵巢均處于休止期，而3—5月份的精巢和卵巢都處于成熟期。相比之下，有些月份的性腺發育同步性差，在10和12月份的樣品中尤為突出：這2個月份的精巢均同時出現了休止期、增殖期和生長期，10月份的卵巢也同時出現了上述3個時期，而12月份的卵巢則涵蓋了休止期、增殖期、生長期和成熟期4個發育時期。

(A.精巢；B. 卵巢。A . Testis; B. Ovary.)圖1 蝦夷扇貝性腺發育的周年分布Fig.1 Annual distribution of gonadal developmental stages inPatinopecten yessoensis

2.2 性類固醇激素含量分析

如圖2A所示，在蝦夷扇貝性腺4個發育階段，精巢和卵巢中孕酮含量的變化范圍分別是(3.86±0.64)～ (6.24±1.51) 和(3.47±0.32 )～ (6.52±1.08) ng/g。無論是精巢還是卵巢，休止期的孕酮含量都高于其它3個時期。比較各發育時期的精巢和卵巢之間的差異，發現孕酮含量在整個發育過程中均無顯著差異。

在性腺4個發育時期中，精巢的睪酮含量范圍是(0.72±0.21)～ (1.01±0.37) ng/g，卵巢的睪酮含量范圍是(0.64±0.10)～ (0.99±0.12) ng/g(見圖2B)。雖然睪酮的含量在各發育時期的精巢和卵巢之間并無顯著差異，但除休止期以外，精巢中睪酮的含量都高于卵巢。

蝦夷扇貝精巢中雌二醇含量范圍是(1.90±0.26)～(2.37±0.88)ng/g，卵巢中的含量范圍是(2.43±0.59)～ (2.71±0.30) ng/g(見圖2C)。盡管精巢和卵巢之間雌二醇的含量差異在性腺各發育時期均不顯著，但卵巢中雌二醇的含量始終高于精巢。

統計每個樣品中三種激素的總含量，結果如圖2D所示。精巢和卵巢中激素總含量的變化范圍分別是(6.69±0.94)～ (9.19±2.21)和(6.78±1.00)～ (10.21±0.66) ng/g，精巢和卵巢之間3種激素的總含量在增殖期差異最小，在休止期、生長期和成熟期雖有差異但并不顯著。

圖2 性類固醇激素在蝦夷扇貝性腺4個發育時期的含量所有數據均表示為平均值±標準誤 (n=3)Fig. 2 Sex steroids concentrations in the four gonadal developmental stages ofPatinopecten yessoensiseach value is represented as a mean±SEM (n=3)

分析蝦夷扇貝精巢和卵巢中3種激素含量的相關性，結果如表1所示。在精巢中，3種激素間均呈顯著正相關(P<0.01)；而在卵巢中，僅孕酮與睪酮含量呈顯著正相關(P<0.01)，雌二醇與其它2種激素含量的相關性并不顯著。

表1 蝦夷扇貝精巢和卵巢中三種性類固醇激素之間的相關性Table 1 Correlation between the three sex steroids in the testis and ovary ofPatinopecten yessoensis

注：**表示Pearson相關系數顯著性<0.01。

Note：**indicates the significance of Pearson correlation coefficient was<0.01.

2.3 3種激素占比隨性腺發育的變化

分析孕酮、睪酮、雌二醇相對于激素總含量的百分比(見圖3)，結果顯示，以上三種激素分別約占激素總含量的60%、10%、30%。除生長期外，精巢中孕酮的比例均略高于卵巢(見圖3A)。睪酮比例在生長期精巢和卵巢之間差異顯著(P<0.05)，精巢高于卵巢，但在休止期、增殖期和成熟期中差異并不明顯(見圖3B)。雖然在4個性腺發育階段中，雌二醇的比例在精巢和卵巢之間均不顯著，但各時期卵巢中雌二醇所占比例均高于精巢(見圖3C)。

2.4 激素相對比值的變化情況

本文進一步探究了精巢和卵巢中3種激素兩兩比值(睪酮/孕酮、雌二醇/睪酮和雌二醇/孕酮)隨性腺發育過程的變化，結果如圖4所示。精巢和卵巢中睪酮/孕酮變化范圍分別是(0.12±0.02)～(0.24±0.02)和(0.14±0.03)～(0.19±0.01)。雖然精巢和卵巢中睪酮/孕酮在性腺4個發育時期差異都不顯著，但可以看出，除休止期外，精巢中睪酮/孕酮都高于卵巢，生長期精巢和卵巢的睪酮/孕酮差異最大(見圖4A)。

雌二醇/睪酮在精巢4個發育時期的變化范圍是(2.08±0.23)～(3.19±0.41)，在卵巢中的變化范圍是(2.74±0.03)～(4.31±1.57)。卵巢中雌二醇/睪酮在增殖期、生長期和成熟期都高于精巢，在生長期二者差異顯著(P<0.05)(見圖4B)。

圖3 性類固醇激素所占比例在蝦夷扇貝性腺4個發育時期的變化
Fig.3 Variations of the percentage of three sex steroids in the four gonadal developmental stages ofPatinopectenyessoensis

雌二醇/孕酮在精巢和卵巢各發育階段中的變化范圍分別是(0.36±0.03)～(0.49±0.09)和(0.42±0.09)～(0.77±0.26)。雖然在性腺發育4個時期中，雌二醇/孕酮在精巢和卵巢之間差異均不顯著，但卵巢中雌二醇/孕酮始終高于精巢，成熟期差異最大(見圖4C)。

3 討論

3.1 性腺發育階段分布頻率

本研究分析了山東萊州蝦夷扇貝性腺四個主要發育階段的周年分布：休止期(7—9月)、增殖期(10—12月)、生長期(1—2月)、成熟期(1—6月)。這與李文姬等對大連獐子島蝦夷扇貝性腺周年變化規律的分析結果基本一致[11]。在櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)中，性腺各發育階段的分布為：增殖期(1—3月)、生長期(4月)、成熟期(5—9月)、生殖期(5—10月)和休止期(11—12月)[12]。相比櫛孔扇貝，蝦夷扇貝的性腺發育要早一些，這可能跟蝦夷扇貝的最適生長溫度低于櫛孔扇貝有關。

圖4 睪酮/孕酮、雌二醇/睪酮和雌二醇/孕酮比值在蝦夷扇貝性腺4個發育時期的水平
Fig.4 The levels of testosterone/progesterone, estradiol/testosterone and estradiol / progesterone in the four gonadal developmental stages ofPatinopectenyessoensis

研究發現蝦夷扇貝在同一月份出現性腺發育不同步的現象。6—7月的精巢和卵巢都同時出現了休止期和成熟期(6月份精巢/卵巢：50%休止期和50%成熟期；7月份精巢：60%休止期和40%成熟期；7月份卵巢：66.7%休止期和33.3%成熟期)；10月份和12月份的精巢同時出現休止期、增殖期和生長期(10月份：9.1%休止期、81.8%增殖期和9.1%生長期；12月份：14.3%休止期、78.6%增殖期和7.1%生長期)，10月份的卵巢出現了休止期(5.9%)、增殖期(64.7%)和生長期(29.4%)，12月份的卵巢則涵蓋了休止期(15.4%)、增殖期(69.2%)、生長期(7.7%)和成熟期(7.7%)。類似現象在櫛孔扇貝和青蛤(Cyclinasinensis)中也有報道。比如，2月份的櫛孔扇貝性腺同時出現增殖期和生長期，12月份同時出現休止期和增殖期[5]；4月份的青蛤性腺同時出現休止期和增殖期，5月份同時出現增殖期和生長期，6月份同時出現生長期和成熟期[13]?？梢?，相比櫛孔扇貝和青蛤，蝦夷扇貝的性腺發育同步性較差，同一月份可同時涵蓋3種甚至4種發育時期。

3.2 不同貝類性類固醇激素含量的差異

本研究采用ELISA試劑盒檢測了蝦夷扇貝性腺中孕酮、睪酮、雌二醇三種激素的含量。其中，雌二醇的含量范圍(1.90～2.71 ng/g)與之前日本學者用高效液相色譜(HPLC)檢測的結果(1.6～4.6 ng/g)接近[9]。分析結果表明，蝦夷扇貝性腺中孕酮含量最高，雌二醇其次，睪酮最低。而在蛤仔(Ruditapesdecussatus)的性腺中，孕酮含量也明顯高于雌二醇和睪酮[4]。與已知的大多數軟體動物相比，蝦夷扇貝性腺中孕酮(3.47～6.52 ng/g)、睪酮(0.64～1.02 ng/g)和雌二醇(1.90～2.71 ng/g)的含量較高。比如：在蛤仔性腺中孕酮、睪酮和雌二醇的含量分別為0.18～2.46、0.04～0.38、0.01～0.24 ng/g[4]，在櫛孔扇貝性腺中雌二醇和睪酮的含量分別為0.08～0.67和0.09～0.51 ng/g[5]。蝦夷扇貝性腺中性類固醇激素含量為何較高尚不清楚，有待后續研究。

3.3 貝類性類固醇激素隨生殖周期的變化

在蝦夷扇貝性腺4個發育階段，孕酮、睪酮、雌二醇的含量在精巢和卵巢之間均無顯著差異。而Osada等在之前的報道中也發現，在蝦夷扇貝性腺發育過程中，雌二醇的含量在精巢和卵巢之間并無差異[9]。類似的現象也存在于其它物種，比如，在淺溝蛤(Scrobiculariaplana)中，雌二醇的含量在雌雄性腺之間無顯著差異[14]，砂海螂(Myaarenaria)兩性性腺的睪酮和雌二醇水平差異也不顯著[15]。但并非所有的軟體動物都呈現一致的變化趨勢，比如在縊蟶(Sinonovaculaconstricta)、福建牡蠣(Crassostreaangulata)、櫛孔扇貝等物種的性成熟過程中，精巢和卵巢的性類固醇激素水平就存在明顯差異，睪酮和雌二醇的含量隨著生殖周期發生變化[5,16-17]。

雖然孕酮、睪酮、雌二醇含量在蝦夷扇貝的精巢和卵巢之間并無顯著差異，但是本研究發現，3種激素含量的相關性在精巢和卵巢中有明顯不同，主要體現在雌二醇與其它兩種激素含量的相關性上，在精巢中是顯著的，但在卵巢中不顯著。而且雌二醇/睪酮在生長期的精巢和卵巢之間差異顯著，卵巢的雌二醇/睪酮高于精巢。這表明性類固醇激素的性別二態分布在蝦夷扇貝生長期是存在的。性腺雌二醇與睪酮的比值變化在櫛孔扇貝中也有報道，其卵巢中雌二醇/睪酮全年顯著高于精巢，而且生長期是卵巢與精巢差異加劇的拐點[5]。以上結果暗示，蝦夷扇貝和櫛孔扇貝性腺可能都具有催化睪酮向雌二醇轉化的能力，即存在芳香化酶，且該酶的催化活性在生長期的扇貝卵巢中高于精巢。但由于編碼芳香化酶的基因Cyp19A1僅在脊索動物才開始出現[18]，扇貝中的芳香化酶是否由P450家族的其它基因編碼，有待后續研究。