SO42-/TiO2固體酸降解蓮房中高聚體原花青素研究

陳衛航， 張 惠， 張 婕

(鄭州大學 化工與能源學院，河南 鄭州 450001)

0 引言

原花青素(Proanthocyanidins，PC)是一種抗氧化劑[1].經研究發現，其是目前世界上清除人體自由基最有效的天然產物，大量存在于植物的種子、花和皮等部位中，在醫藥、保健品、化妝品領域應用廣泛.蓮房含有豐富的原花青素，如提取，可變廢為寶[2].原花青素按聚合度劃分，分為低聚體(平均聚合度≤4)和高聚體(平均聚合度>4).低聚體的抗氧化活性遠遠高于高聚體，故高聚體降解為低聚體的研究成為熱點[3].

目前，原花青素的催化降解方法主要有氫化降解法、微生物降解法、化學降解法等.氫化降解法設備昂貴、反應條件苛刻、操作相對復雜，但降解率高；微生物降解法設備簡單低廉、操作簡便、零二次污染，但合適的微生物難尋，且難培養；化學降解法因設備低廉、操作簡便、降解率高等優點已引起國內外研究者的廣泛關注，故本研究選用化學降解法.化學降解法主要為酸降解法，Luo等[4]采用亞硫酸作為酸降解劑，將葡萄籽及皮中原花青素降解為低聚體；趙平等[5]同樣采用亞硫酸作為酸降解劑，將原花青素的平均聚合度從7.06降到4.30.

考慮到實際應用中，涉及領域對物質的純度要求極其高，所以必須保證降解產物的純度達到一定的標準.酸降解劑參與降解反應后，不易進行分離，這勢必會影響產物的純度和后續應用，故筆者在文獻[6-7]的基礎上首次提出采用固體酸作為催化劑降解高聚體原花青素.

1 試驗方案

1.1 試驗原材料

新鮮蓮房，市售；蒸餾水，實驗中心自制；兒茶素，98%，鄭州希派克科技有限公司；乙醇、冰乙酸，天津市風船化學試劑科技有限公司，AR；乙酸乙酯、甲醇、濃鹽酸，天津市科密歐化學試劑有限公司，AR；硫酸，煙臺市雙雙化工有限公司，AR；芳草醛，阿拉丁工業公司，AR；1#、2# TiO2，瑪雅試劑有限公司(1、2號分別指100 nm TiO2、P25TiO2).

1.2 試驗儀器

電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州市中原科技玻璃儀器廠；飛鴿牌離心機，上海安亭科技儀器廠；電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；循環水式多用真空泵，鞏義市英峪華科儀器廠；馬弗爐，上海黔通儀器科技有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，島津企業管理有限公司；WQF-510傅里葉變換紅外光譜儀，北京瑞利分析儀器廠；ASAP 2 460比表面積及孔隙分析儀，美國Micromeritics有限公司；Agilent 1 100凝膠滲透色譜，安捷倫科技有限公司.

1.3 試驗內容

1.3.1 蓮房高聚體原花青素的提取

將干燥的新鮮蓮房粉碎，并過粒徑為0.15 mm篩子得蓮房粉末.將蓮房粉浸漬于石油醚中，料液比為4∶15 (g/mL)，脫脂24 h.脫脂后，于通風處自然風干.采用溶劑法提取原花青素.提取劑為60%的乙醇溶液，料液比為1∶15 (g/mL)，50 ℃下浸提60 min.提取液于10 000 r/min轉速下離心，上清液在45 ℃下旋轉蒸發以回收乙醇，得到原花青素粗提液[8].然后用乙酸乙酯3次萃取分級，水相即為高聚體原花青素懸浮液.將其稀釋10倍作為降解原料.

1.3.2 固體酸的篩選及制備

篩選4種酸溶液和2種固體載體，確定采用降解性能好的H2SO4溶液和吸附性能佳的納米級TiO2[9].分別取5 g 1#、2# TiO2，配置1、2、3 mol/L的硫酸溶液各10 mL/g.浸漬沉淀法分別浸漬1 h[10].抽濾后，濾餅于真空干燥箱在90 ℃下烘24 h，取出研碎，過粒徑為0.15 mm篩子.再置于400 ℃的馬弗爐中活化3 h，制備出的固體酸冷卻后待用.

1.3.3 固體酸降解反應實驗

取10 mL降解原液，加入一定量的SO42-/TiO2固體酸催化劑，放入一定溫度的水浴鍋內，降解反應一定時間.取出后過濾固體酸并冷卻液體至室溫，測定原花青素的平均聚合度及降解率.

平均聚合度采用魏冠紅(2006年)的改良香草醛法測定[11].當采用乙酸作為溶劑時，香草醛只與末端黃烷-3-醇發生縮合反應，從而可以確定原花青素的摩爾量.當采用甲醇作為溶劑時，香草醛可以與所有酚羥基發生反應，從而可以確定原花青素的質量.二者結合即可求出原花青素的平均聚合度.

1.4 聚合度及降解率的計算

原花青素的平均聚合度可通過公式(1)計算；原花青素的降解率可通過公式(2)計算:

(1)

式中:DP為平均聚合度；m為原花青素的質量濃度，μg/mL；n為原花青素的摩爾濃度，μmol/mL；M為兒茶素的摩爾質量，290.27 g/mol.

(2)

式中：DP1為降解前的平均聚合度；DP2為降解后的平均聚合度.

1.5 工藝優化試驗

在單因素實驗的基礎上設計正交試驗,以找出最優降解反應條件.

1.6 表征

通過FT-IR、BET分析來表征SO42-/TiO2固體酸的性能；通過降解原料與降解產物的紫外光譜及凝膠色譜對比分析來驗證降解反應效果.

2 分析與討論

考察載體TiO2顆粒大小、固體酸用量、反應溫度、反應時間對高聚體原花青素降解效果的影響.

2.1 固體酸降解反應工藝

2.1.1 單因素實驗

(1)TiO2顆粒大小對降解反應的影響.采用不同粒度TiO2(1#及2#納米級TiO2)作載體，制備1 mol/L SO42-/TiO2，在適宜條件下做降解實驗.

保持溫度80 ℃，時間60 min的反應條件不變.1# TiO2作載體制備的固體酸的加入量選擇0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 g；2# TiO2作載體制備的固體酸的加入量選擇0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g·/(10 mL),所得結果如圖1所示.

圖1 TiO2顆粒大小對聚合度的影響 Fig.1 TiO2 particle size impacts on polymeric degree

載體粒度的大小直接影響著改性催化劑性能的好壞.由圖1可以看出：當聚合度降為4.25時，1# TiO2作載體的催化劑消耗0.2 g，2# TiO2作載體制備的催化劑需0.05 g.達到相同的降解效果，粒徑較小的2# TiO2作載體制備的催化劑用量少得多.故以下實驗中催化劑用量、反應溫度、反應時間對降解效果的研究，均采用2# TiO2制備的固體酸.

(2)H2SO4濃度及酸用量對降解反應的影響.保持溫度80 ℃，時間60 min的反應條件不變，采用不同濃度(1、2、3 mol/L)H2SO4制備的SO42-/TiO2固體酸，加入量均為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g·(10 mL)-1,所得結果見圖2和圖3.

圖2 固體酸加入量對聚合度的影響 Fig.2 Solid acid addition impacts on polymeric degree

圖3 固體酸加入量對降解率的影響 Fig.3 Solid acid addition impacts on degradation rate

由圖2、圖3可以看出：一定范圍內，隨著固體酸加入量的增加，聚合度先降低后升高，降解率先升高后下降.1、2、3 mol/L的SO42-/TiO2固體酸均有降解作用，但是其中2 mol/L SO42-/TiO2固體酸的降解效果最佳.當硫酸濃度為2 mol/L時，固體酸的加入量為0.04 g·(10 mL)-1，聚合度從5.95降為3.26，降解率達到45.21%.故考慮溫度和時間對降解反應的影響時，只對2 mol/L硫酸制得的固體酸做討論.

(3)溫度對降解反應的影響.保持固體酸加入量0.04 g、時間60 min的條件不變，采用不同的反應溫度，即50、60、70、80、90 ℃，所得結果見圖4.

圖4 溫度對聚合度及降解率的影響 Fig.4 Temperature impacts on polymeric degree and rate

反應溫度的高低直接影響反應活化能的大小，進而影響降解反應效果.由圖4可以看出：一定范圍內，隨著溫度的不斷升高，聚合度先減小后增大，降解率先增加后減小.溫度為70 ℃時，聚合度降為2.31，降解率達到61.18%.溫度較低時，高聚體很難將C4—C8鍵斷開，故聚合度較高，降解率較低；溫度過高時，低聚體的羥基基團很容易被氧化，從而失去原有的活性，這與上述的實驗結果是相符的.

(4)時間對降解反應的影響.保持固體酸加入量為0.04 g·(10 mL)-1，溫度為70 ℃的條件不變，采取不同的反應時間，即40、50、60、70、80 min，所得結果如圖5.

圖5 時間對聚合度及降解率的影響 Fig.5 Time impacts on polymeric degree and rate

由圖5可以看出：當時間為40～60 min時，聚合度明顯減??；當時間為60～80 min時，聚合度增大，但較為緩慢.反應時間過長，聚合度反而升高，降解率反而降低.原因可能是降解后的低聚體原花青素隨時間增加又發生了裂解，生成了別的產物.當時間為60 min時，聚合度降為2.31，降解率達到61.18%.

2.1.2 正交實驗

依據單因素實驗的結果，以SO42-/TiO2固體酸加入量、降解溫度及降解時間為變量因素，設計正交實驗，以考察上述條件對蓮房原花青素降解反應的綜合影響.設計的正交實驗水平因素表見表1，正交實驗結果表見表2.

表1 正交實驗L9(34)水平因素表 Tab.1 Horizontal factor table of orthogonal experiment

表2 正交實驗L9(34)結果

由正交實驗結果的極差分析可得因素的影響大小順序為：B>A>C，即溫度>酸用量>時間.其中，最佳方案為A1B2C2，即固體酸用量為0.04 g·(10 mL)-1，溫度為70 ℃，時間為60 min.在該反應條件下，高聚體聚合度可以從5.95降為2.31.由于空白列的極差較小，所以表明本次正交實驗沒有遺漏掉其他主要參考因素.

2.1.3 驗證試驗

固體酸用量0.04 g·(10 mL)-1為邊界條件，故需做驗證試驗.設計酸用量0.03 g·(10 mL)-1，溫度70 ℃，時間60 min的實驗方案進行降解實驗，結果見表3.由表3可知：酸用量0.04 g·(10 mL)-1時，降解效果最佳.綜上所述，固體酸降解蓮房高聚體原花青素的最佳工藝條件為：催化劑選擇2號TiO2負載2 mol/L H2SO4制備SO42-/TiO2，酸用量0.04 g·(10 mL)-1，溫度70 ℃，時間60 min，原花青素聚合度從5.95降為2.31，降解反應效果最好.

表3 驗證試驗結果

2.2 固體催化劑的表征

2.2.1 FT-IR分析

SO42-負載在TiO2上面，結合力有無機螯合狀雙配位、共價硫酸鹽、橋式配位.紅外光譜如圖6所示.由圖6看出：1、2、3 mol/L SO42-/TiO2固體酸的1 413.57、1 413.57、1 552.42 cm-1處的反對稱伸縮振動吸收峰屬于共價鍵性質的S—O鍵，即共價硫酸鹽吸附.而對于對稱伸縮振動吸收峰，941.09、985.45、987.38 cm-1的吸收帶屬于共價硫酸鹽吸附，889.02、881.31 cm-1的吸收帶屬于螯合式吸附.與純TiO2紅外圖對比，SO42-已負載在TiO2上面.

圖6 純TiO2及不同濃度硫酸處理得到SO42-/TiO2 固體酸的紅外光譜 Fig.6 Infrared Spectrum of pure TiO2 and SO42-/TiO2

2.2.2 SO42-/TiO2固體酸的BET分析

SO42-/TiO2的BET見表4.由表4可知：改性TiO2與未處理TiO2相比，H2SO4濃度為1 mol/L和2 mol/L時，比表面積均增大；H2SO4濃度為3 mol/L時，比表面積大幅度減小，故H2SO4濃度不是越大越好.硫酸濃度小時，比表面積增大可能是TiO2與SO42-結合產生多孔結構造成的；硫酸濃度增大時，比表面積減小可能是硫酸鹽覆蓋在多孔上造成的.

2.2.3 原料與降解產物的紫外光譜分析

由圖7可知，降解前原花青素與降解后產物的最大吸收波長均為500 nm，且兩者的紫外吸收光譜相近,故降解產物具有原花青素分子中黃烷醇單元的特征吸收峰，也證實固體酸降解主要斷裂的是單體間的鏈接鍵，而并未破壞黃烷醇單元的結構.

表4 不同濃度硫酸制備的固體酸SO42-/TiO2的比表面積 Tab.4 Specific surface area of solid acid SO42-/TiO2 m2·g-1

圖7 降解前后物質的最大吸收波長 Fig.7 Maximum absorption wavelength of the material

2.2.4 原料與降解產物的GPC分析

凝膠色譜的工作原理為：分子量大的物質先出峰，分子量小的物質后出峰.圖8表明：降解反應前，原花青素主要以高聚物存在；降解反應后，高聚體含量大大減少，低聚體含量增加.所以說，固體酸降解反應達到了目的.

圖8 降解前后物質的凝膠色譜 Fig.8 Gel chromatography of substances

3 結論

筆者制備出性能良好的SO42-/TiO2固體酸催化劑，可以有效地降解高聚體原花青素，以實現生物活性最高的二聚體原花青素的制備.實驗確定了固體酸降解高聚體原花青素的最佳工藝條件，采用2#納米級TiO2制備出的含H2SO4濃度為2 mol/L的SO42-/TiO2固體酸，固體酸加入量0.04 g·(10 mL)-1，反應溫度70 ℃，反應時間60 min.此條件下高聚體的平均聚合度從5.95降為2.31，降解率可達到61.18%.紫外光譜表明，固體酸降解反應沒有破壞原花青素應有的分子結構.凝膠色譜表明，降解產物低聚體含量顯著增多.這說明降解反應得以實現.此研究所確定的工藝條件及實驗結果為蓮房原花青素的充分和高效利用提供了有效的途徑.