結核病實驗室檢測技術的研究進展

羅 風，李曉非，丁彩梅

(昆明市第三人民醫院檢驗科，昆明650041)

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)復合群為結核病的病原菌，導致人患肺結核的致病菌90%以上為MTB，該菌主要通過飛沫傳播，通過消化道及損傷皮膚等途徑感染機體也偶有報道[1]。結核病的致死率高于獲得性免疫缺陷綜合征，在全世界范圍內其病死率居傳染性疾病排行榜第一位，據統計2016年全球估計有1 040萬新發結核病患者，10%為新患結核病的兒童，130萬結核病患者死亡，其中20萬兒童結核病患者死亡,且兒童結核病大部分是由患活動性肺結核的成人患者傳染而得；同時提出我國耐多藥結核病負擔居世界第二位，2016年耐藥結核病占新增結核病的4.1%[2-5]。當前我國結核病防治現狀形勢嚴峻，結核病患病人口基數大，病例發現率低，常被誤診及延遲治療，主要是由于臨床上缺乏針對結核病準確、快速、簡便的實驗室檢測及病情監測技術[5-9]?，F對近年來國內外各項結核病實驗室檢測技術的優缺點及臨床應用范圍進行歸納，總結該領域當前研究的熱點及難點，以期為臨床結核病早期精準診治及病情監測探索更實用的實驗室檢測技術。

1 細菌學檢測技術

結核病診斷的金標準為MTB細菌學檢查陽性；MTB細菌學檢查方法包括細菌涂片顯微鏡檢測技術和細菌分離培養技術，由于其細菌學檢查的陽性檢出率不高，導致臨床上結核病診斷出現大量的漏診及誤診現象[2]。

1.1標本涂片方法 由于傳統的直接涂片法不容易檢出MTB，臨床工作者不斷進行各種濃縮集菌涂片法的嘗試，以期提高MTB的檢出率[10]。一項研究收集864份痰標本同時進行夾層杯離心集菌涂片法和傳統涂片法檢測MTB，結果前者檢測的陽性率較后者高11.92%，且前者操作簡便、易于標準化，說明前者是一種優于傳統涂片法的檢測方法[11]。李淑敏等[12]提出改良抗酸染色法與傳統抗酸染色法相比檢出率提高到88.57%，同時改良法可以檢測到胞內桿菌；改良法是將傳統法的試管離心改為玻片離心，然后triton破膜后行抗酸染色。李雪蓮和高孟秋[13]提出應用玻片離心改良抗酸染色法，可將傳統方法的檢出率提高至61.7%。以上方法有效提高了涂片查找MTB的檢出率。

1.2齊-尼(Ziehl-Neelsen)染色鏡檢法 Ziehl-Neelsen是目前國內外常用的抗酸染色法，染色后在普通光學顯微鏡下觀察MTB菌體呈紅色，背景呈藍色。該法是臨床上確診肺結核的可靠方法，是世界衛生組織(World Health Organization,WHO)推薦的結核病診斷方法之一，具有簡單、快速和可靠等優點；該法的缺點是欠敏感，不能區分MTB與非MTB(欠特異)，在疾病的不同階段診斷敏感性不同，無法分辨死菌與活菌，易受標本質量及檢驗人員技術水平的影響，結果陰性也不能排除結核病[7]。

1.3發光二極管熒光顯微鏡鏡檢法 發光二極管熒光顯微鏡鏡檢法是在熒光染色鏡檢法的基礎上應運而生的，是繼傳統顯微鏡檢查后的一大突破。WHO已推薦其逐步取代傳統熒光顯微鏡，同時作為傳統光學顯微鏡的替代技術[14]。與傳統顯微鏡相比，發光二極管熒光顯微鏡更持久耐用，鏡光柔和成本低，光路調節簡單，不需要暗室環境同時極大提高了檢測敏感性，同時其對檢驗人員的技術水平要求不高，基層醫院人員只要經過培訓熟練掌握后即可開展工作，目前該方法已在發達國家普遍推廣[15-17]。但是發光二極管熒光顯微鏡檢測MTB也存在與傳統檢測方法相同的弊端，即其無法區分MTB和非MTB、死菌和活菌。在發光二極管熒光顯微鏡的基礎上又出現了自動化數字顯微圖像結核病檢測技術系統，它是一種可以自動處理熒光顯微圖像以識別MTB同時報告檢測結果的新技術，該系統可以提高對活動性結核病診斷的敏感性和特異性，其性能相當于一個經驗豐富的MTB檢驗醫師，缺點是有時仍需要人工閱片復檢[18-19]。

2 分子生物學檢測技術

盡管當前結核病實驗室診斷技術不斷進步，對調查結核病發病機制非常有利，但要分析這種緩慢生長病原體的基本基因功能以及為臨床提供快速準確病原學檢測結果仍非常困難[20]。分子生物學檢測技術以其獨特的優勢正迅猛發展且逐步取代傳統的MTB檢測技術[21]。

2.1基因編輯技術——規律間隔的短回文重復序列干擾技術(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-interference，CRISPRi) CRISPRi技術自問世以來，在編輯真核和原核生物基因方面發揮著極大作用，同時成為研究MTB基因功能的新工具，有望成為一種穩定、易于設計和可擴展的調節基因沉默的平臺[22]。CRISPRi系統抑制生物細胞靶基因表達的原因是Cas9-引導RNA復合體同與引導RNA互補的DNA結合，導致空間位阻的產生，以致終止RNA聚合酶的轉錄，最終結果是抑制靶基因的表達[23]。Choudhary等[24]在2015年成功構建了CRISPRi系統，該系統能高效抑制MTB基因表達；Singh等[25]在2016年成功運用CRISPRi系統實現了對MTB幾個功能基因的表達抑制。由于CRISPRi系統中化膿性鏈球菌Cas9在MTB中較低的基因敲除效率和蛋白毒性，Rock等[26]對此問題進行深入研究發現嗜熱鏈球菌Cas9的CRISPRi系統蛋白毒性最小同時其基因調控更精準。CRISPRi系統可用于MTB不同生長階段，且能對多個功能基因同時進行表達調控，是一種高效率、廣泛適用的基因編輯技術，期待該系統在MTB功能基因組學、遺傳相互作用和藥物靶標分析等方面發揮更大的作用[27]。

2.2利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術 MTB利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(GeneXpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，GeneXpert MTB/RIF)是近年來MTB分子診斷方面的突破之一，是由Cepheid公司研發的全自動半定量巢式實時熒光定量檢測技術，包括Xpert MTB/RIF檢測試劑盒及“GeneXpert”聚合酶鏈反應平臺，適用儀器為GeneXpert；該技術可從待測標本中檢測出MTB復合群同時判斷其耐藥性(僅針對利福平)，引物和探針是依據單拷貝基因rpoB耐藥決定區而設計，對操作人員的技術水平要求低，整個檢測過程安全無污染在密閉環境進行，2 h即可出結果[28-29]。2016年Gürsoy等[30]為評價Xpert MTB/RIF實驗在臨床樣本中檢測MTB的診斷性能，采用Xpert MTB/RIF試驗方法對2 160份標本(肺內標本1 141份，肺外標本1 019份)進行測試，結果顯示其檢測對于肺外標本、肺內標本及全部標本的靈敏度分別為63.9%、77.5%、73.3%，特異度分別為99.2%、99.5%、99.3%。該研究說明Xpert MTB/RIF技術對所有樣本檢測的特異度較高，雖然對肺外樣本的敏感性處于中等水平，但也提示其對肺外結核的快速診斷有一定價值。余麗等[31]對Xpert MTB/RIF技術診斷MTB進行研究，發現其有很高的準確度，這與Gürsoy等[30]研究結果一致，同時該團隊采用梯度濃度稀釋法得出Xpert MTB/RIF技術檢測MTB的最低檢出限達300 CFU/mL，該數據與傳統培養法基本相似，且得出在檢測樣本中MTB含量低于300 CFU/mL時，易出現利福平耐藥假陽性的結果。由于兒童難以提供呼吸道標本，Banada等[32]利用Xpert MTB/RIF技術對南非班德地區40例(20例已確診肺結核、20例為健康對照)兒童糞便進行MTB檢測，結果發現取0.6 g和1.2 g糞便標本進行檢測的靈敏度分別為85%和84%，特異度分別為100%和94%。以上研究說明Xpert MTB/RIF的檢測結果會受到標本類型及標本量的影響，同時也說明該方法對兒童結核病的診斷也較為理想，另有研究報道該方法在排除疑似結核病患者方面有極大的診斷價值[33]。由于其能在快速準確地診斷結核病的同時檢測MTB的利福平耐藥性，WHO將Xpert MTB/RIF技術替代傳統MTB檢測技術作為診斷兒童肺結核、結核病/HIV雙重感染患者的首選檢測方法[34]。

2.3環介導等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification,LAMP) LAMP是以核酸擴增為基礎的實驗技術，該技術克服了聚合酶鏈反應技術需要熱循環設備價格高以及對操作人員技術要求高等缺點，同時該技術采用4個MTB特異性引物以識別目標DNA上的6個不同的特異性區域以縮短反應時間并提高反應的特異度及靈敏度[13，35]。Bojang等[36]分別采用LAMP、細菌培養和Xpert MTB/RIF 3種方法對來自岡比亞441例患者的痰標本進行MTB檢測同時對檢測結果進行比較，結果以細菌培養為參考方法LAMP診斷結核病的總靈敏度為99%，特異度為94%，同時該研究得出LAMP和GeneXpert MTB/RIF有相似的高靈敏度及特異度。Yan等[37]對LAMP、同步擴增實驗和Xpert MTB/RIF在以往實驗室培養為參考方法診斷肺結核方面的研究中進行了薈萃分析，發現LAMP診斷的靈敏度和特異度為93%和94%，同步擴增實驗診斷的靈敏度和特異度為96%和88%，Xpert MTB/RIF診斷靈敏度和特異度為89%和98%。由以上研究可知LAMP實驗過程中不需要熱循環儀器進行DNA擴增，具有快速、特異、靈敏和穩定等優點。LAMP也存在不足，由于該檢測法是針對MTB的DNA為靶序列設計引物同時進行擴增，對死菌也表現為陽性結果，因此該方法不能對臨床抗結核治療效果進行監測，且實驗過程中DNA雙鏈結構穩定不易降解[38-39]。

2.4逆轉錄-環介導等溫擴增技術(reverse transcription-LAMP,RT-LAMP) RT-LAMP的擴增體系含逆轉錄酶、RNA酶抑制劑和RNA模板，這是與LAMP技術的幾個不同之處[40]。由于16S rRNA為單鏈結構且僅大量存在于代謝增殖的活MTB中，因此合并反轉錄功能RT-LAMP技術能在LAMP技術的基礎上進一步提高檢測靈敏度，同時還可以判定活菌[41-43]。吳丹丹等[40]為了比較RT-LAMP和LAMP檢測結核病的靈敏度和特異度，對122例患者(100例確診肺結核患者、22例非結核菌感染患者)的痰標本分別采用RT-LAMP、LAMP、羅氏固體培養法進行MTB檢測，以羅氏固體培養法進行對比，結果顯示RT-LAMP在靈敏度和活菌檢測方面存在LAMP不可超越的優勢。由于RT-LAMP有技術操作簡便同時可對臨床抗結核治療效果進行評估等優點，更適用于基層醫療單位使用。

2.5全基因組測序 隨著測序技術的成熟、測序成本的降低，全基因組測序已在MTB的研究中發揮了巨大作用[44-45]，該技術是采用高通量測序儀對微生物的基因組核酸測序，以獲取該細菌全部基因組DNA序列的方法。由于MTB自發突變率低，可以采用全基因組測序來分析菌株間單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism,SNP)差異，然后通過SNP對MTB進行菌種鑒定、判斷其傳播方向、分辨復發與再感染或混合感染[46-48]。說明該方法在MTB流行病學研究方面有不可取代的地位?，F有的耐藥分子檢測手段基本完成了利福平和異煙肼等一線抗結核藥物的耐藥診斷，而且其靈敏度和特異度可達90%以上[49]，但是目前已知的耐藥突變位點不能解釋所有表型耐藥，若使用全基因組測序技術對MTB的相關基因耐藥突變進行檢測，則耐藥檢測就不再僅局限于幾種一線抗結核藥物，且該方法可以檢測出更多的MTB藥敏信息[50]?？茖W家們通過全基因組關聯性分析探討SNP與MTB表型之間的關系，Walker等[51]共收集3 000多株臨床分離株進行全基因組測序及全基因組關聯性分析，最終沒有發現新的可靠耐藥突變位點，考慮可能與臨床菌株的遺傳背景差異大、耐藥機制復雜等有關。全基因組測序的優點為可以更準確、全面地診斷出MTB的菌種、基因突變位點及其耐藥信息等，缺點為依賴細菌培養技術、分析流程繁瑣、數據量大、現有研究結果異質性大等[52]。Brown 等[53]曾嘗試脫離MTB細菌培養過程，將痰標本直接進行全基因組測序，并取得成功。盡管關于全基因組測序當前還有很多問題尚未解決，但其憑借極高的正確度、檢測速度快等優勢在發達國家已列入結核病常規診斷流程，在我國則多用于科學研究。

2.6基因芯片技術 在20世紀90年代初期，隨著生物化學、遺傳學等多學科交融發展以及多物種基因組測序的完成，DNA微陣列應運而生，即基因芯片技術?；蛐酒菍⒏鶕﨧TB全基因組中保守的功能基因序列和SNP位點而設計的探針固定在一定的載體上，再加入熒光標記的待測樣本核酸，通過分析熒光雜交信號來進行菌株鑒定，細菌基因分型，耐藥性分析等；當前臨床常用的有基因檢測芯片，菌種分型芯片和耐藥檢測芯片等。王丹吉等[54]分別采用基因芯片技術，羅氏培養技術和傳統藥敏試驗對1 297例肺結核患者的痰標本進行MTB異煙肼、利福平等耐藥性的檢測，以傳統藥敏方法為金標準，基因芯片檢測異煙肼的特異度和靈敏度分別為97.42%、81.91%，檢測利福平的特異度和靈敏度分別為98.18%、84.48%，結果說明基因芯片技術對于MTB耐藥性的檢測具有較高的靈敏度與特異度，非常適用于耐多藥結核病的早期診斷。但其檢出限達不到300 CFU/mL，說明敏感性不如GeneXpert MTB/RIF技術。許榕青等[55]研究結果提示以BACTEC MGIT960藥敏結果為參考，基因芯片技術對異煙肼耐藥性檢測表現出較低的敏感性，且對于利福平耐藥檢測基因芯片法與基因測序結果也不完全一致，說明基因芯片檢測的MTB基因位點范圍略窄。針對基因芯片檢測技術靈敏度不高這一問題，科研工作者應考慮進一步擴大基因芯片檢測MTB基因位點范圍?？傊?，基因芯片技術可以快速直接對痰標本MTB進行耐藥性檢測，檢測結果具備較好的特異度與靈敏度，可以為臨床結核病的診治提供快速準確的實驗室檢測數據。

3 小 結

目前我國結核病實驗室檢測技術已取得長足進步，不少新的實驗室檢測技術已在各級醫療機構進行推廣普及，新技術的應用也提高了結核病的診斷率。但當前用于結核病實驗室檢測的技術各有其優缺點，評價一種新技術的普適性需要大樣本、大范圍、多地區和多中心的臨床實踐來驗證。為更好地解決以上問題，應該從宏觀角度整合醫療衛生資源，加強相關人員學習及應用結核病實驗室檢測新方法、新技術的認知理念，逐步形成對新技術的驗證、推廣機制，提高我國整體結核病防治工作服務水平，以期在臨床實踐中不斷對新技術進行改進和創新。相信通過各級結核病實驗室對新技術的合理運用，我國臨床結核病實驗室診斷水平將會出現質的突破，從而更好地為臨床結核病精準防治提供強力支持。