溴化烷基吡啶鹽提取紅花脂溶性總黃酮的研究

孟丹,周娜,王鑫,王東偉,魏玲玲,郭穎瓊,趙三虎,*

(1.山西師范大學 化學與材料科學學院,山西 臨汾 041001;2.忻州師范學院 化學系,山西 忻州 034000)

0 引言

紅花又稱紅藍花、草紅花、刺紅花等,屬于菊科植物,主要生長在中亞地區,在我國集中分布于新疆、河南、四川等地[1]。紅花中含有豐富的藥理活性成分,至今已經分離得到包括查爾酮、黃酮苷、生物堿及聚炔類等多種類型的化合物超過 104 種[2-4]。紅花中的黃酮類物質被認為是具有生物活性代表性的化學成分,其傳統提取方法主要有醇提法[5]、微波輔助法[6]及超聲輔助法等[7],這些方法由于提取效率低或對提取設備要求高等原因,為其規?；a帶來很大的不便?；诖?研究紅花中黃酮類物質的提取方法備受關注[8-9]。

離子液體(ILs)是一種由有機陽離子和無機陰離子組成的低熔點熔融鹽[10]。由于其對有機、無機物具有良好的溶解性，低蒸氣壓以及低毒等特性,被認為是一種傳統有機溶劑的綠色替代品[11-13]。本文根據文獻方法合成了6種吡啶類離子鹽,并將其水溶液作為萃取劑,在微波輔助作用下提取紅花中的脂溶性總黃酮。通過紫外分光光度法與單因素實驗相結合的方法探究了影響提取效果的因素,以期發展一種快速提取紅花中脂溶性總黃酮的方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與材料

UV-2550型紫外可見分光光度計(日本島津公司),XH-200A型電腦微波固液相合成/萃取儀(北京祥鵠科技發展有限公司),Bruke AVANCE Ⅲ 600 MHz全數字化超導核磁共振譜儀(瑞士布魯克拜厄斯賓(Bruker Biospin)公司)。

槲皮素標準品(中國預防醫學科學院勞衛所)、無水乙醇及其他試劑均為分析純。實驗所用紅花產自新疆,干燥粉碎過40目篩后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 離子鹽的合成

參照文獻方法[14],合成了6種吡啶類離子鹽:溴化1-乙基吡啶、溴化1-正丁基吡啶、溴化1-正己基吡啶、溴化1-正辛基吡啶、溴化1-正癸基吡啶、溴化1-正十二烷基吡啶。產品結構經1H NMR及13C NMR 光譜表征,結果如下:

溴化1-乙基吡啶:白色晶體,產率91%,熔點117℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.26(d,J=5.5 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.21 (t,J=7.0 Hz,2H,=CH-),4.73(q,J=7.3 Hz,2H,=NCH2-),1.56(t,J=7.3 Hz,3H,-CH3);13C NMR (126 MHz,DMSO)δ136.49,123.51,122.22,48.71,35.75,31.23,29.40,28.86,28.79,25.46,22.04,13.88.

溴化1-正丁基吡啶:白色晶體,產率92%,熔點104℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.31(s,2H,N=CH-),8.65(s,1H,=CH-),8.20(s,2H,=CH-),4.87-4.51(m,2H,=NCH2-),1.90(s,2H,-CH2-),1.27(s,2H,-CH2-),0.91(s,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.50,144.77,128.04,60.19,32.70,18.66,13.30.

溴化1-正己基吡啶:白色晶體,產率89%,熔點45℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.23(d,J=5.5 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.23-8.17(m,2H,=CH-),4.68(d,J=7.4 Hz,2H,=NCH2-),1.97-1.87(m,2H,-CH2-),1.28(s,6H,-(CH2)3-),0.86(d,J=6.7 Hz,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.98,145.26,128.55,61.28,31.18,31.01,25.48,22.31,14.28.

溴化1-正辛基吡啶:白色晶體,產率90%,熔點29℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.21(d,J=5.6 Hz,2H,N=CH-),8.65(t,J=7.8 Hz,1H,=CH-),8.23-8.16(m,2H,=CH-),4.67(t,J=7.5 Hz,2H,=NCH2-),2.03-1.86(m,2H,-CH2-),1.33-1.14(m,10H,-(CH2)5-),0.85(t,J=7.0 Hz,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ145.97,145.25,128.55,61.10,31.59,31.23,28.90,28.81,25.84,22.50,14.40.

溴化1-正癸基吡啶:無色油狀黏稠液體,產率87%;1H NMR(600 MHz,DMSO) δ 9.24(s,2H,N=CH-),8.65(d,J=1.0 Hz,1H,=CH-),8.19(d,J=13.4 Hz,2H,=CH-),4.67(t,J=10.4 Hz,2H,=NCH2-),1.94-1.85(m,2H,-CH2-),1.24(m,14H,-(CH2)7-),0.83(t,J=5.3 Hz,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.97,145.26,128.47,61.06,31.73,31.25,29.34,29.26,29.11,28.87,25.84,22.55,14.40.

溴化1-正十二烷基吡啶:白色固體,產率85%,熔點74℃;1H NMR(600 MHz,DMSO)δ 9.24(s,2H,N=CH-),8.66(s,1H,=CH-),8.20(d,J=7.1 Hz,2H,=CH-),4.69(s,2H,=NCH2-),1.99-1.84 (m,2H,-CH2-),1.25 (d,J=19.8 Hz,18H,-(CH2)9-),0.85 (t,J=7.0 Hz,3H,-CH3);13C NMR(126 MHz,DMSO)δ 145.97,145.26,128.55,61.06,35.61,32.72,31.77,29.48,29.19,28.89,28.55,27.97,25.86,22.56,14.40.

1.2.2 微波輔助吡啶類離子鹽水溶液提取紅花活性成分

準確稱取0.15 g研磨好的紅花粉末于雞心瓶中,加入20 mL 1 mol/L 離子鹽水溶液,在400 W,50℃的條件下微波萃取5 min,待樣液冷卻后,抽濾,將濾液轉移到50 mL容量瓶中,用少量離子鹽水溶液洗滌容器和殘渣,與提取液合并,用離子鹽水溶液定容至刻度線。然后從容量瓶中取0.50 mL紅花提取樣液于10 mL比色管中,用離子鹽水溶液定容、搖勻,得到樣品溶液。在300～500 nm下對樣品進行紫外檢測,測其吸光度,計算總黃酮提取量。

1.2.3 傳統方法提取

準確稱取0.15 g研磨好的紅花藥材粉末于雞心瓶中,然后加入20 mL體積分數70% 乙醇,回流提取3 h。待提取液溫度降至室溫后,抽濾,將濾液轉移至50 mL的容量瓶中,用少量70%乙醇洗滌容器和提取后的殘渣,將洗滌液與提取液合并,然后用70% 乙醇定容。從容量瓶中取0.50 mL紅花提取液,置于10 mL比色管中,然后用70% 乙醇定容,得樣品溶液。將樣品溶液進行紫外檢測,計算總黃酮的提取率。

1.2.4 提取溫度的確定

準確稱取0.15 g研磨好的紅花粉末于雞心瓶中,加入20 mL 1 mol/L溴化1-癸基吡啶鹽水溶液,分別在400 W,40℃、50℃、60℃的條件下微波萃取5 min,待樣液冷卻后,抽濾,將濾液轉移到50 mL容量瓶中,然后再用少量的離子鹽水溶液洗滌雞心瓶和提取后的殘渣,與提取液合并,用離子鹽水溶液定容。然后從容量瓶中吸取0.50 mL紅花提取樣液,置于10 mL比色管中,用離子鹽水溶液定容、搖勻,得樣品溶液。將樣液在300～500 nm下進行紫外檢測,測其吸光度,計算總黃酮提取量。

1.2.5 提取劑濃度的確定

準確稱取0.15 g研磨好的紅花粉末于雞心瓶中,然后分別加入20 mL 0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L的溴化1-癸基吡啶鹽離子鹽水溶液于上述雞心瓶中,在400 W、50℃的條件下微波萃取5 min,待樣液冷卻后,抽濾,將濾液轉移到50 mL容量瓶,用少量離子鹽水溶液洗滌雞心瓶和提取后的殘渣,再與提取液合并,用離子鹽水溶液定容。然后從容量瓶中吸取0.5 mL紅花提取樣液,置于10 mL比色管中,用離子鹽水溶液定容、搖勻,得樣品溶液。在300～500 nm下對樣品溶液進行紫外檢測,測定其吸光度,計算總黃酮提取量。

1.2.6 DPPH抗氧化實驗

首先用無水乙醇配制1×10-4mol/L DPPH溶液,在10 mL比色管中分別移入相同濃度的5.0 mL、5.5 mL、6.0 mL、6.5 mL、7.0 mL的黃酮提取液和Vc溶液,再加入3.0 mL DPPH溶液,定容。把比色管放在黑暗處,避光反應30 min后在517 nm處測它的吸光度。按照下式計算清除率:

DPPH的清除率%=[A0-(A1-A2)]/A0×100

Fig.1 Standard curve of quercetin圖1 槲皮素標準曲線

式中:A0為未加黃酮溶液測定的吸光度值;A1為測定液的吸光度值;A2為無DPPH的溶液所測定的吸光度值。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

準確稱取10 mg槲皮素標準品,用適量無水乙醇完全溶解,將溶解后的溶液定容到50 mL容量瓶中,得0.2 mg/mL的槲皮素標準品母液。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL槲皮素標準品母液于10 mL比色管中,用無水乙醇定容,用紫外分光光度計測其吸光度,得回歸方程:Y=72.86X-0.020 4(R2=0.998 8),槲皮素標準曲線見圖1。

2.2 不同離子鹽水溶液提取紅花脂溶性總黃酮

表1 不同離子鹽水溶液提取效果比較

Fig.2 UV absorption of general flavone extracted by different ionic salts solution圖2 不同離子鹽水溶液提取紅花總黃酮的紫外吸收

在微波輔助下,用1 mol/L離子鹽水溶液作為提取劑,(不同離子鹽水溶液提取紅花總黃酮的紫外吸收如圖2所示。)與傳統乙醇提取法相比,提取率得到了顯著提升;6種烷基鏈長短不同的溴化烷基吡啶類離子鹽水溶液都顯示了好的提取效果,其中離子鹽[C10Py]Br水溶液的提取率最高,提取率達1.98%,高于70%乙醇作為提取劑的0.3%。分析表1中數據,6種烷基鏈長短不同的溴化烷基吡啶類離子液體水溶液作為提取劑,雖然整體趨勢是提取率越來越高,但對提取率的影響呈之字形,當用12個碳的烷基吡啶離子液體作為提取劑時,提取率顯著降低。其原因可能是離子液體烷基鏈長短的變化,影響了溶液的極性,進一步影響黃酮的溶出性;另外烷基鏈長短發生變化,離子液體的破壁能力也發生變化,二者共同作用,導致提取率呈之字形變化。

2.3 提取溫度的確定

表2 溫度對[C10Py]Br提取效果的影響

由于紅花中主要黃酮在溫度60℃以上不穩定[15],所以設置提取溫度為40℃、50℃、60℃。由圖3和表2可知,溴化1-癸基吡啶鹽離子鹽水溶液作為提取劑時,50℃為較優溫度。

2.4 提取劑濃度的確定

表3 [C10Py]Br的濃度對提取效果的影響

由圖4和表3可知,50℃提取紅花總黃酮時,[C10Py]Br濃度為1 mol/L時效果最好。

Fig.4 UV absorption of different [C10Py]Br concentration圖4 不同[C10Py]Br濃度提取下的紫外吸收

Fig.5 Effect of flavonoids on DPPH free radicals圖5 紅花黃酮對DPPH自由基的清除效果

2.5 DPPH抗氧化實驗結果

實驗結果如圖5所示,在黃酮濃度為0.029 8～0.038 5mg/mL的范圍內,紅花中黃酮對DPPH清除能力隨著它濃度的增加而減小;黃酮濃度為0.038 5～0.042 0 mg/mL時,黃酮對DPPH的清除能力隨其濃度的增大而增大。當黃酮濃度為0.029 8 mg/mL時,DPPH清除率最大,為98.78%,IC50為0.038 6 mg/mL。為了進一步驗證離子液體溶劑對清除DPPH的影響,進一步做了有離子液體及無離子液體的Vc溶液對DPPH的清除實驗,未見離子液體對Vc溶液清除DPPH有明顯影響。雖然紅花中黃酮在濃度為0.032 8 mg/mL之后對DPPH清除能力沒有抗壞血酸的清除能力高,但紅花黃酮對DPPH還是有較強的清除效果。

3 結論

通過單因素實驗,探究了吡啶類離子鹽水溶液作為提取劑用于紅花總黃酮的提取,發現離子鹽烷基鏈的長短、離子鹽濃度及提取溫度對提取率都有較大的影響,濃度為1 mol/L的[C10Py]Br水溶液作為提取劑,在50℃、微波輔助作用下可有效提取紅花中的脂溶性總黃酮。與傳統乙醇提取法相比,該方法所用時間短、提取率高。離子液體對提取效果的增強可能是由于其良好的破壁能力及溶出性能,使紅花中脂溶性總黃酮溶出更多、更快。DPPH抗氧化實驗進一步證明該方法提取的紅花總黃酮在低濃度時對DPPH有較強的清除能力。該方法選用了對環境友好的離子鹽作為提取劑,不僅高效、便捷,而且易于規?；?是一種可選擇的提取紅花總黃酮的方法。同時,由于該方法所用時間短、黃酮溶出性高,可用于快速檢測紅花脂溶性總黃酮的含量,進一步用于紅花品質的鑒定。