溶磷細菌篩選及對復墾土壤磷素有效性的評價

喬志偉，騰飛龍，邵曉貴

(1.安順學院資源環境與工程學院，貴州 安順 561000；2.安順學院農學院，貴州 安順 561000)

井工開采是煤炭開采的最主要方式，目前我國90%以上的煤碳都是井工開采[1]，這種方式必然會造成地表沉陷，山西約有一半的地下采空區發生了地面塌陷[2]， 地面塌陷導致耕地被大面積的破壞，作物產量減少，對人類的居住和生產活動都有一定程度的危害，土地復墾迫在眉睫.研究表明，提高復墾土壤肥力是采煤塌陷地土地復墾成功與否的關鍵[3-4]，其中最主要的限制因子是復墾土壤中的磷素養分[5]，溶磷微生物參與土壤中難溶態磷素有效性的轉化[6-9]，因此在復墾土壤上研究溶磷微生物具有重要的意義.

目前關于溶磷細菌在復墾土壤上應用研究較多[10-14]，其基本方法是將溶磷細菌通過合適的基質吸附后，單獨或者配合無機、有機肥施入復墾土壤中，研究其對土壤磷素的影響，試驗結果都表明溶磷細菌可以提高復墾土壤磷素有效性，這些研究為溶磷細菌在復墾土壤上的應用提供了定性的方法.但是土壤磷素有效性受植物根際[15]、土壤微生物[16]、環境[17]等多方面因素影響，在提高復墾土壤磷素有效性中土壤溶磷微生物的作用有多少，目前國內外相關研究都未明確指出.本試驗從土壤中分離篩選溶磷細菌，采用室內培養的方法，通過在復墾土壤上接種菌株，并設置滅菌菌株的對照處理，單獨研究溶磷細菌對復墾土壤有效磷、磷酸酶、各無機磷形態含量的影響，為評價溶磷細菌在提高復墾土壤有效性的作用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 溶磷細菌的篩選

1.1.1 土樣采集 土樣采自于山西農業大學農學院實驗基地，采樣地種植作物為玉米，蔬菜等，采樣深度0～20 cm，土壤為石灰性褐土，將采集的土樣除去植物根系和雜草，保存于4 ℃冰箱，24 h內用于溶磷細菌的分離和篩選.

1.1.2 培養基 (1)溶磷細菌分離培養基(改良后的PVK培養基):葡萄糖10 g,Ca2(PO4)35 g,(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.2 g,KCl 0.2 g,MgSO40.1 g,FeSO4·7H2O 0.002 g,MnSO4·4H2O 0.002 g,0.4%溴酚藍(pH6.7)10 mL,酵母浸膏0.5 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養基20 g瓊脂，pH自然；(2)溶磷細菌篩選培養基(NBRIP培養基)：葡萄糖10 g,Ca2(PO4)35 g,MgCl 5 g,(NH4)2SO40.1 g,KCl 0.2 g,MgSO40.25 g,蒸餾水1 000 mL，固體培養基20 g瓊脂，pH自然；(3)溶磷細菌保存和活化培養基：牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，固體培養基20 g瓊脂，pH自然.

1.1.3 溶磷細菌的分離篩選 稱取10 g新鮮土樣放在有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，在搖床上振蕩30 min，用10倍稀釋法分別稀配至10-7的土壤懸濁液，將10-5、10-6、10-7的土壤懸濁液分別涂布在PVK培養基平板上，倒置于培養箱中，28 ℃培養3～5 d，待菌落長出后，觀察在平板上是否產生溶磷圈對菌株進行初步的篩選；在平板培養基上多次劃線純化后，對在平板上仍產生透明圈層的菌株，將其保存于置于4 ℃冰箱.

1.1.4 溶磷細菌溶磷能力的測定 將培養7 d的磷細菌培養液于4 ℃，6 000 r/min的條件下離心8 min，取上清液2 mL 于250 mL三角瓶中，加入0.5 mol/L NaHCO350 mL,在180 r/min的振蕩機上振蕩30 min后過濾后，用鉬銻抗比色法測定.

1.1.5 溶磷細菌16sRNA序列的測定 采用引物7f (5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)，1540r (5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′) 建立擴增反應體系并測序，將獲得的DNA序列輸入GenBank，用Blast 程序與數據庫中的所有序列進行比較分析，確定其屬種.

1.2 溶磷細菌對復墾土壤有效磷及不同形態無機磷含量的影響

1.2.1 試驗菌株 從1.1中篩選鑒定出的菌株中選擇不同種屬的溶磷細菌作為試驗菌株，同一種屬的選擇溶磷能力強的菌株.

1.2.2 種子培養基 葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g,NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，KH2PO42.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然.

1.2.3 試驗土樣 土樣采自于山西省長治市襄垣縣潞安集團采煤塌陷區復墾第4年耕層土壤，有效磷為8.37 mg/kg，有機質為10.01 g/kg，全氮0.41 g/kg，全鉀20.4 g/kg，全磷0.71 g/kg，堿解氮為25.33 mg/kg，土壤pH為8.01.

1.2.4 試驗設計 將土樣風干且過2mm的篩后做滅菌處理備用，在250 mL三角瓶中裝滅菌土壤，每瓶裝土50 g.按照種子培養基的配方配制液體培養基并分裝在250 mL三角瓶中，每瓶裝液100 mL后滅菌；將在固體斜面保存好的試驗菌株分別接種在滅菌冷卻后的種子培養基中，每一菌株接種兩瓶，28 ℃培養24 h后測定菌數，將每種菌株菌數稀釋至108CFU/mL；每一菌株接種稀釋后的兩瓶中，將其中一瓶繼續滅菌，做為未滅菌的對照處理.分別將各株菌株稀釋后未滅菌的菌液5 mL加入到裝有滅菌土壤的三角瓶中，每一菌株重復3次，并將各株菌株稀釋后滅菌的菌液5 mL加入到裝有滅菌土壤的三角瓶中，每一菌株重復3次，在另外3個裝有滅菌土壤的三角瓶中分別裝入5 mL無菌水，做為空白對照，每個三角瓶充分振蕩均勻后放置在28 ℃恒溫培養箱中，定期管理.

1.2.5 測定指標及方法 在培養箱培養60 d后取出三角瓶，采集土樣待風干后過1 mm篩，測定土壤有效磷、pH、堿性(酸性)磷酸酶、無機磷形態等指標.土壤有效磷測定采用鉬銻抗比色法測定[18]；pH采用pH計直接測定[18]；堿性(酸性)磷酸酶測定采用關松蔭磷酸苯二鈉比色法[19]；無機磷分級采用蔣-顧的石灰性土壤無機磷分級的測定方法[20].

1.3 數據處理

本文數據采用方差分析和Duncan新負極差法(a=0.05)等數學統計方法，分析軟件為Excel 2003、SAS V8.1.

2 結果與分析

2.1 溶磷細菌的篩選

經過初步篩選、分離和純化，得到具有明顯溶磷圈的菌株7株，并對7株溶磷細菌溶解磷酸三鈣的能力進行測定，7株溶磷細菌菌落直徑、溶磷圈直徑及溶磷能力如表1所示.由表1可知7株磷細菌在磷酸三鈣培養液中有效磷含量都高于300 mg/L，7株溶磷細菌對磷酸三鈣都具有較強的溶解能力，其溶解能力大小依次為W7>W3> W5>W4>W2>W1=W6；其中W7在培養液中得有效磷含量最高，為594.9 mg/L，溶磷能力最強，為563.5 mg/L，顯著高于其他菌株(P<0.05).

7株菌株的溶磷圈直徑在1.20～2.55 cm，W6溶磷圈直徑最小，為1.20，W4溶磷圈直徑最大，為2.55；各菌株溶磷圈直徑與菌落直徑的比值在1.20～2.79之間；W6D/d值最小，為1.20， W7D/d值最大，為2.79；7株菌株溶磷能力與其溶磷圈大小的線性相關系數為R2為0.21，相關性不顯著，而7株菌株溶磷能力與菌株D/d大小的線性相關系數為R2為0.88，呈極限著正相關(P<0.01)，因此可以根據溶磷圈直徑與菌落直徑的比值，在一定程度上反應菌株溶磷能力的大小.

2.2 溶磷細菌的鑒定

以各菌株的總DNA為模板，利用細菌16S rRNA引物進行PCR擴增，得到擴增產物，將7株菌測序結果采用BLAST軟件與Genbank中的序列比較.7株菌株鑒定結果如表2所列：

表1 7株磷細菌溶磷圈及溶磷能力

表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Different lowercase letters in the same table indicate significant difference (P<0.05).

2.3 溶磷細菌對復墾土壤有效磷及pH的影響

選擇W1(Enterobactersp.)、W3(Rahnellasp.)、W4(Burkholderiasp.)和W7(Fluorescentpseudomonas)作為試驗菌株，通過在復墾土壤上添加溶磷細菌菌液和對應菌株的滅菌菌液，研究溶磷細菌對復墾土壤有效磷、磷酸酶及各形態無機磷含量的影響.接種溶磷細菌及其滅菌菌液處理復墾土壤有效磷含量及pH見表3.由表3可知，溶磷細菌可以增加復墾土壤有效磷含量和降低土壤pH，與加滅菌菌液相比，接種W1、W3、W4、W7菌液處理復墾土壤有效磷含量分別增加了0.30～3.72 mg/kg，菌株W3對復墾土壤有效磷含量的增加量最多，為3.72 mg/kg；四株菌株對復墾土壤pH的降低值在0.03～0.09之間.

表2 解磷菌株鑒定結果

2.4 溶磷細菌對復墾土壤磷酸酶含量的影響

接種溶磷細菌及其滅菌菌液處理復墾土壤堿性磷酸酶及酸性磷酸酶含量見表4.由表4可知，溶磷細菌可以增加復墾土壤堿性磷酸酶的含量，與接種滅菌菌液相比，接種W1、W3、W4、W7菌株菌液處理復墾土壤堿性磷酸酶含量分別顯著增加13.18、15.12、34.22、9.68 mg/kg， 接種W4菌液處理復墾土壤堿性磷酸酶含量增加量最大，為34.22 mg/kg，比添加W4滅菌菌液處理顯著增加了112.6%；接種W7菌液處理復墾土壤堿性磷酸酶含量增加量最小，為9.68 mg/kg，比添加W7滅菌菌液處理顯著增加了20.5%.溶磷細菌同時可以增加復墾土壤酸性磷酸酶的含量，與接種滅菌菌液相比，接種W1、W3、W4、W7菌液處理復墾土壤酸性磷酸酶含量增加范圍在0.21～47.66 mg/kg，菌株W7對復墾土壤酸性磷酸酶含量的增加效果最顯著.

表3 不同種溶磷細菌復墾土壤有效磷含量及pH值

表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

表4 不同種溶磷細菌復墾土壤堿性和酸性磷酸酶含量

表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Different lowercase letters in the same table indicate significant difference (P<0.05).

2.5 溶磷細菌對復墾土壤各形態無機磷含量的影響

根據蔣-顧的石灰性土壤無機磷分級測定方法，將土壤中的無機磷形態分為二鈣磷(Ca2-P)、八鈣磷(Ca8-P)、十鈣磷(Ca10-P)、鐵磷(Fe-P)、鋁磷(Al-P)、閉蓄態磷(O-P)等6種形態，本試驗中無機磷形態按照上述方法測定.

2.5.1 溶磷細菌對復墾土壤Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P含量的影響 接種溶磷細菌及其滅菌菌液處理復墾土壤Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P含量見表5.由表5可知，溶磷細菌可以增加復墾土壤Ca2-P、Ca8-P含量，顯著減少Ca10-P含量.與接種滅菌菌液相比，接種W1、W3、W4、W7菌液處理復墾土壤Ca2-P、Ca8-P含量分別增加4.7%～33.8%和11.1%～26.0%，Ca10-P含量減少12.9%～14.9%.4株菌株中W1和W7對復墾土壤Ca2-P的增加效果顯著，W1、W4、W7對復墾土壤Ca8-P的增加效果顯著，W1、W3、W4、W7可以顯著減少復墾土壤Ca10-P的含量，溶磷細菌對各形態鈣磷影響較大，尤其是可以顯著減少土壤中Ca10-P的含量.

表5 不同種溶磷細菌復墾土壤Ca2-P、Ca8-P、Ca10-P含量

表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

空白處理土壤Ca10-P含量為456.28 mg/kg，接種W1、W3、W4、W7滅菌菌液處理復墾土壤Ca10-P含量分別比空白增加97.46、103.38、99.45、95.73 mg/kg，接種W1、W3、W4、W7菌液處理復墾土壤Ca10-P含量分別比空白增加24.71、28.25、16.42、14.92 mg/kg，因此溶磷細菌可以抑制復墾土壤中有效磷向Ca10-P的轉化.

2.5.2 溶磷細菌對復墾土壤Fe-P、Al-P、O-P含量的影響 接種溶磷細菌及其滅菌菌液處理復墾土壤Fe-P、Al-P、O-P含量見表6.由表6可知，溶磷細菌可以增加復墾土壤Fe-P、Al-P含量，對O-P影響不顯著.與接種滅菌菌液相比，接種W1、W3、W4、W7菌液處理復墾土壤Fe-P、Al-P含量分別增加5.3%～24.1%和4.8%～30.0%.四株菌株中W3、W4、W7對復墾土壤Fe-P和Al-P增加效果顯著，溶磷細菌對Fe-P和Al-P的影響也較大.

表6 不同種溶磷細菌復墾土壤Fe-P、Al-P、O-P含量

表中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05).

Different lowercase letters in the same table indicate significant difference (P<0.05).

3 討論

溶磷微生物最明顯的標志是可以在PVK固體培養基平板上產生溶磷圈，這也是目前篩選溶磷微生物最常用的方法之一，但是在試驗篩選過程中，由于在平板上長出的菌落較多且相互之間的競爭關系，大多數菌株的溶磷能力受到抑制，并不是所有的菌株都會出現溶磷圈在平板上，且溶磷圈大小與溶磷能力之間是否存在相關性還有待研究，Nautial[21]、馮哲葉[22]、馬驄毓等[23]研究表明，溶磷圈的大小不能代表其溶磷能力的大小，本試驗中7株菌株溶磷能力與溶磷圈大小之間的關系并不顯著，而與溶磷圈直徑/菌落直徑的比值呈顯著正相關，因此溶磷圈僅是作為識別溶磷微生物的標志之一，在篩選強溶磷能力菌株時，應綜合考慮其磷圈直徑/菌落直徑的比值和對其溶磷能力進行培養測定.

溶磷微生物可以溶解難溶態磷[24]，其溶磷機理具有多樣性，產生低分子量有機酸是主要的溶磷途徑[25]，本試驗中接種溶磷細菌菌液與對應的滅菌菌液相比，復墾土壤有效磷含量增加，pH減小，這與孟會生[10]、李娜[26]等在復墾土壤上施用溶磷細菌后土壤磷素指標的變化一致；溶磷細菌還可以分泌磷酸酶促進土壤磷素轉化[25]，本試驗中，接種磷細菌菌液的處理復墾土壤磷酸酶含量都增加，但是試驗結果表明接種4株菌株土壤磷酸酶含量的增加量與復墾土壤有效磷的變化無顯著關系，W4菌株堿性磷酸酶比滅菌菌液處理增加了112.6%，增加量顯著高于其他菌株，接種W4有效磷含量僅增加了0.3 mg/kg，出現這一結果的原因可能是磷酸酶主要作用于土壤有機磷，土壤有機磷的轉化是一個長期的過程并需要大量的微生物參與，本試驗時間周期為60 d且土壤是經過滅菌的復墾土壤，復墾土壤養分含量極低，滅菌的土壤中土著微生物基本上被殺滅，微生物參與這一過程的作用也大大減弱，不同溶磷細菌在土壤中的生長繁殖情況各不相同以及不同菌株在土壤磷素活化方面的作用機理不同，這些方面都會影響菌株對土壤磷素的作用.溶磷微生物由于其特定的溶磷特性，必須會對土壤磷素形態產生影響，范丙全等[27]研究表明，施用溶磷草酸青霉菌的土壤Ca2-32P、Ca8-32P比例增加，Ca10-32P比例降低；Gong等[28]研究表明，溶磷微生物可以促進難溶態Ca10-P和緩效態Ca8-P向有效態磷的轉化，土壤中有效態磷Ca2-P和Al-P含量增加；劉玲利等[11]在復墾土壤上研究溶磷細菌對磷素形態的影響，結果表明溶磷細菌處理增加了易溶態磷含量，難溶態磷含量減少；本試驗中溶磷細菌可以增加Ca2-P、Ca8-P、Fe-P、Al-P含量，并且可以顯著抑制土壤中有效磷向Ca10-P的轉化，溶磷細菌可以對各形態無機磷含量產生影響.本試驗中各處理間6種形態的無機磷含量在總量上沒有呈現出一致性的規律，主要原因是不同菌株在生長過程中對土壤磷素的需求不相同，生長活動旺盛的菌株從土壤中吸收的磷就多，以此來維持自身生長的需要，有部分無機磷轉換成微生物磷.

本次試驗排除了植物根際、土壤微生物、環境因素等對土壤磷素有效性的影響，單獨研究了溶磷細菌對提高復墾土壤磷素有效性中作用，試驗結果證明溶磷細菌在復墾土壤上對磷素有效性有重要的作用.因此在復墾土壤上施用溶磷細菌，應構造適合其生長的土壤、作物、微生物等環境條件，使其在提高化學磷肥利用率、減少土壤磷素累積和流失方面發揮更重要的作用.

4 結論

1) 7株菌株的溶磷能力在296.5～563.5 mg/L之間，菌株的溶磷能力與溶磷圈直徑(D)/菌落直徑(d)的比值呈顯著正相關；通過16sRNA序列分析鑒定，W1、W6屬于Enterobactersp.，W2、W4屬于Burkholderiasp.，W3、W5屬于Rahnellasp.，W7屬于Fluorescentpseudomonas.

2) 溶磷細菌可以提高復墾土壤有效磷含量、降低pH、增加磷酸酶含量，與接種滅菌菌液處理相比，4株溶磷細菌對復墾土壤有效磷增加在0.30～3.72 mg/kg之間，降低pH 0.03～0.09之間，土壤堿性和酸性磷酸酶提高幅度在9.68～34.22 mg/kg和0.21～47.66 mg/kg.

3) 溶磷細菌可以增加復墾土壤Ca2-P、Ca8-P、Fe-P、Al-P的含量，顯著減少復墾土壤Ca10-P，對O-P影響不顯著.與接種滅菌菌液處理相比，接種W1、W3、W4、W7菌液復墾土壤Ca2-P、Ca8-P、Fe-P、Al-P的增加范圍分別在4.7%～33.8%、11.1%～26.0%、5.3%～24.1%、4.8%～30.0%，Ca10-P的減少幅度在12.9%～14.9%.