復方皂礬功能洗發香波對馬拉色菌體外抑菌活性的實驗研究

高坤平 楊文信

（西南醫科大學附屬中醫院皮膚科，四川 瀘州 646000）

脂溢性皮炎又稱為脂溢性濕疹，是發生在皮脂腺豐富部位如頭皮、前胸、腋窩，的一種炎癥性皮膚病。以紅斑、丘疹、鱗屑為主要皮損表現，同時伴有不同程度的瘙癢，中醫稱為“油面風”“白屑風”等。病程日久，反復發作，形成惡性循環，甚至擴展至全身，嚴重影響患者生活質量［1］。馬拉色菌（malassezia）是皮膚表面的常駐菌，與脂溢性皮炎的發病密切相關，是導致頭皮脂溢性皮炎的重要原因［2］。治療脂溢性皮炎的主流是抗真菌治療，西藥治療復發率高，不良反應大。因此，尋找作用安全、療效滿意的抗馬拉色菌藥物的任務巨大。中醫以整體觀念與辨病辨證為理論基礎，物美價廉，高效低毒，具有獨特的優勢。復方皂礬功能洗發香波為純中藥制成，使用舒適，安全性好。目前治療脂溢性皮炎的中藥或復方中藥外洗劑缺乏深入系統科學的實驗研究，多以個案或個別單位小樣本量臨床研究為主［3］。為深入研究其作用機制所以我們對復方皂礬功能洗發香波進行了體外抗馬拉色菌藥敏實驗。

1 實驗材料

1.1 菌株 （1）臨床馬拉色菌株：由我院微生物室分離鑒定獲得。（2）標準菌株：廣東微生物研究所微生物保藏中心提供糠秕馬拉色菌 GIMCC編號：GIM2.181=ATCC44344。

1.2 中藥 西南醫科大學附屬中醫院制劑科用1000 mL 60%的乙醇浸潤方劑（白礬2 g，苦參10 g，皂角5 g，側柏葉10 g，地膚子5 g，苦柏10 g等取5付藥材，除白礬外粉碎成粗粉末），裝柱，最終藥液含藥量2.0 g/mL，高壓滅菌冷凍存儲。采樂洗劑（西安楊森制藥公司，國藥準字：H20000588）：2%酮康唑洗劑。

1.3 真菌培養基的主要試劑 固體培養基：成分：氯霉素50 mg、橄欖油2.7 g、吐溫600.5 mL、酵母浸膏1 g等液體培養基：成分：麥芽糖20 g，橄欖油40 g，吐溫600.5 mL、酵母浸膏20 g等。

2 實驗方法

2.1 瓊脂平板擴散法 打孔法［4］

2.1.1 固體培養基的制備 融化的固體培養基，工作臺上將其倒入每個平皿中（約12 mL）。

2.1.2 菌液配制 在固體培養基上接種受試菌株，每72 h傳代培養1次，放入35℃恒溫孵箱孵育，傳代培養2次后，制成菌懸液，菌含量大概為（1.0～2.0）×106CFU/mL。

2.1.3 抑菌活性的測定 將菌液2 mL均勻的涂布在培養基平板上，無菌打孔器在馬平板上打直徑為10 mm的孔，孔內加入稀釋成不同濃度的藥液，恒溫孵箱內培養72 h，再用游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

2.1.4 結果判讀 用游標卡尺測量抑菌圈直徑，再分別計算出每個濃度的抑菌圈直徑的平均值與標準差。

2.2 微量液基稀釋法 參照NCCLS-M27A方案，以此為基礎改良后采用含4%橄欖油作為作為藥敏試驗的液基［5］。

2.2.1 藥液加樣 在無菌操作臺上將濃度為2 g/mL的中藥貯備液用滅菌蒸餾水在無菌試管內稀釋成試驗濃度（見表3），再依次微量稀釋板每孔中加入100 μL藥液。在無菌試管內采樂洗劑也用滅菌蒸餾水稀釋成試驗濃度（見表4），再依次每孔100 μL加入微量稀釋板。再每孔中加入100 μL的液體培養基。同時不加菌的加入同等濃度100 μL的藥液作為陰性對照，不加藥液的加入100 μL的滅菌蒸餾水作為生長對照。

2.2.2 加菌懸液 菌懸液制備同2.1.2，再向每個微孔板中依次加入100 μL菌液。

2.2.3 培養及結果判讀 培養 72 h后將1 mL培養液點種于不含藥物的無菌馬拉色菌橄欖油固體培養基上，72 h后觀察菌落生長情況。固體培養基無菌生長所對應的藥物濃度確定為MIC值。

2.2.4 MIC值的判讀 生長對照菌落生長良好同時空白對照無菌生長，為減少實驗誤差，判讀重復5次，結果取平均值。

3 結果

3.1 瓊脂平板擴散法（打孔法） 不同濃度洗發香波藥物原液對馬拉色菌的抑菌直徑見表1。不同濃度采樂洗劑對馬拉色菌的抑菌直徑見表2。

表1 不同濃度復方皂礬功能洗發香波藥物原液對馬拉色菌的抑菌直徑

表2 不同濃度采樂洗劑對馬拉色菌的抑菌直徑

3.2 微量液基稀釋法 復方皂礬功能洗發香波藥物原液的MIC值為 0.005 g/mL （見表 3～4，圖 1～4）。

表3 復方皂礬功能洗發香波藥物原液對馬拉色菌標準菌株的MIC值

表4 采樂洗劑對馬拉色菌標準菌株的MIC值

圖1 瓊脂平板擴散法（打孔法）培養前

圖2 瓊脂平板擴散法（打孔法）培養72 h后

圖3 96微孔法培養72 h后

圖4 臨床分離馬拉色菌鏡下圖片

4 討論

選擇采樂作為本研究的對照藥，是因為它為治療脂溢性皮炎常用洗劑。雖然采樂組體外抑制馬拉色菌生長比洗發香波組效果好，但洗發香波作為純中藥制劑，無任何添加，成本低廉，高效低敏，患者樂于接受，值得應用推廣。

馬拉色菌（Malassezia）是人體及溫血動物皮膚表面的條件致病性嗜脂性真菌，該菌可導致多種皮膚病包括花斑癬、馬拉色菌毛囊炎、脂溢性皮炎等，致病病種多，治療也因此受到重視。脂溢性皮炎抗真菌治療為主流。因此我們要尋找安全性好、療效好且價格低廉的抗真菌藥物。從中藥尋找抗真菌藥物，前景廣闊。中藥不良反應小，耐藥少可用于疾病的長期預防治療，結合現代工藝，前景好。

馬拉色菌體外實驗還沒有標準化方案。本實驗采用瓊脂平板擴散法（打孔法）和微量稀釋法。瓊脂平板擴散法（打孔法）雖然操作簡單，結果易判，但結果易受干擾，如培養基厚度，因此本實驗中只定性測定抑菌效果。藥物的MIC值參照NCCLS-M27A方案，在微量孔中進行，操作簡便，結果易判且準確。國內外研表明采用微量法與多量法結果一致，所得的最小抑菌濃度都在2個濃度梯度內［6］。本實驗測得復方皂礬功能洗發香波藥物原液的MIC值為0.005 g/mL。洗發香波糠秕馬拉色菌抑菌作用，為深入探討洗發香波對糖秕馬拉色菌的抑菌機制、動物實驗和臨床研究提供實驗依據。