電子束輻照對帶魚魚糜內源性蛋白酶活性及其構象單元的影響

羅華彬，林 露，高 星，呂梁玉，李高尚，陳燕婷，張進杰，楊文鴿*

（寧波大學食品與藥學學院，浙江省動物蛋白食品精深加工技術重點實驗室，浙江 寧波 315211）

在熱誘導魚糜凝膠的形成過程中，當通過40～60 ℃溫度帶時魚糜蛋白往往會發生嚴重降解，形成低彈性魚糜凝膠，甚至不能形成凝膠，這種凝膠劣化現象與魚糜內源性蛋白酶的活性有關，肌原纖維結合型絲氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase，MBSP）和組織蛋白酶L（cathepsin L，Cat-L）等蛋白酶均會促使魚糜肌原纖維蛋白水解及肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）降解，影響魚糜凝膠形成[1-2]。如鯉魚肌原纖維與純化的絲氨酸蛋白酶在55 ℃反應1 h，MHC、α-輔肌動蛋白和肌動蛋白均被降解，魚糜凝膠劣化，并發現在鯉魚魚糜中加入Cat-L會降低魚糜凝膠強度，而同時加入Cat-L及其抑制劑，凝膠強度則會增加，說明絲氨酸蛋白酶和Cat-L均是導致魚糜凝膠劣化的關鍵酶類[3]。Jiang等[4]認為殘留在鯖魚魚糜中的Cat-L可以降解肌球蛋白，引起鯖魚魚糜凝膠劣化；揭珍等[5]在不同溫度下保溫帶魚魚糜，發現在50～75 ℃時肌原纖維蛋白重鏈被降解，三氯醋酸-溶解肽含量增加，并在70 ℃時達到最高值，導致帶魚魚糜凝膠劣化。

作為較新興的食品冷殺菌技術，電子束輻照憑借其能減少農產品產后損失、提高食品加工品質、控制食源性疾病發生等優勢而越來越受到世界各國人們的重視[6-7]。研究表明，電子束輻照對食品蛋白等生物大分子具有獨特的改性作用，能引起蛋白化學作用力及其構象的改變，導致蛋白變性、聚集或凝膠化，同時也能改變魚糜內源性蛋白酶的結構及其活性，從而影響魚糜凝膠的形成[8-9]。如Jaczynski等[10]研究了電子束輻照劑量對狹鱈魚魚糜蛋白結構及其凝膠特性的影響，發現魚糜蛋白的疏水性及二硫鍵含量、凝膠剪切力均隨輻照劑量的增加而增加，6～8 kGy輻照可有效改善狹鱈魚魚糜凝膠品質；Lin Xianping[11]、Deng Siyao[12]等分別對帶魚魚糜和梅魚魚糜進行電子束輻照，發現輻照引起魚糜肌原纖維蛋白α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量升高，5～7 kGy輻照可以顯著提高魚糜凝膠強度，促進凝膠網絡結構的形成。為進一步闡述電子束輻照對魚糜凝膠特性的影響機理，本研究以不同劑量電子束輻照帶魚魚糜，提取各組魚糜內源性MBSP和Cat-L，測定其活力及最適反應溫度，通過圓二色光譜分析其二級結構，探究電子束輻照對帶魚魚糜MBSP和Cat-L的影響，旨在為輻照技術應用于魚糜及其制品的生產提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍帶魚魚糜（貯藏于－20 ℃） 寧波飛日水產實業有限公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA日本Peptide Institute公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；其余試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；ML104/02型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Biofuge Stratos臺式高速冷凍離心機德國Thermo Scientific SORVALL公司；SpectraMax i3多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；NBL-1020電子直線加速器 寧波超能科技股份有限公司；J-1500-150圓二色光譜儀 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 魚糜輻照處理

將冷凍帶魚魚糜300 g/袋真空包裝，利用NBL-1020型電子直線加速器（能量10 MeV）進行輻照，輻照劑量分別為0、1、3、5、7、9 kGy，輻照劑量誤差小于3%，其中0 kGy為對照組。每組劑量設置3 個平行，輻照時各個樣品排列整齊，防止疊壓造成平行樣品之間的差異。對照組和各輻照組魚糜用于MBSP和Cat-L的提取，同時對照組魚糜用于肌原纖維蛋白的提取。

1.3.2 酶的提取

1.3.2.1 MBSP的提取

參考Cao Minjie等[13]的方法略作修改。取各組魚糜適量，加入3 倍體積20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）勻漿，8 000 r/min冷凍離心20 min。沉淀加入4 倍體積蒸餾水，調至pH 6.0，離心，重復3 次。沉淀加入4 倍體積蒸餾水，調至pH 6.0，55 ℃溫育5 min，10 000 r/min冷凍離心20 min。上清液調至pH 4.0，再次離心取上清液，調至pH 6.0，20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）透析，冷凍干燥，低溫保存。

1.3.2.2 Cat-L的提取

參考Hu Yaqin等[14]的方法略作修改。取各組魚糜適量，加入4 倍體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液A（pH 6.8），勻漿，3 000 r/min冷凍離心10 min，重復2 次。沉淀加入3 倍體積50 mmol/L磷酸鹽緩沖液B（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.5）提取20 h，10 000 r/min冷凍離心30 min。上清液加10 倍體積蒸餾水，調至pH 6.8，3 000 r/min離心10 min。沉淀用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液C（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）溶解，50 ℃保溫15 min，10 000 r/min冷凍離心20 min取上清液，用質量分數80%硫酸銨沉淀，同時調至pH 5.5，靜置10 min后10 000 r/min冷凍離心10 min。沉淀用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液D（含5 mmol/L L-半胱氨酸，pH 5.5）溶解，透析后10 000 r/min冷凍離心10 min取上清液。冷凍干燥，低溫保存。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離肌原纖維蛋白

魚糜肌原纖維蛋白的提?。簠⒖糥iong Guangquan等[15]的方法略作修改。取2 g對照組魚糜，加20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0）20 mL，充分勻漿后10 000 r/min離心15 min，沉淀加入20 mmol/L Tris-maleate緩沖液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）20 mL，充分勻漿，靜置提取1 h后10 000 r/min離心15 min，上清液即為魚糜肌原纖維蛋白溶液。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：將提取的MBSP、Cat-L分別配制成0.1 mg/mL酶液，各加5 mL 5 mg/mL肌原纖維蛋白溶液，55 ℃反應10 min，得到肌原纖維蛋白酶解液。參照Laemmli[16]的方法進行SDS-PAGE，分離膠和濃縮膠質量分數分別為10%和5%，酶解液上樣量10 μL，起始電壓80 V，溴酚藍指示劑進入分離膠后電壓改為100 V?？捡R斯亮藍R-250染色，凝膠成像系統拍照分析。

1.3.4 酶活力的測定

1.3.4.1 MBSP活力的測定

參考Cao Minjie等[17]的方法。將MBSP溶于蒸餾水中，取MBSP溶液50 μL，依次加入900 μL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）和50 μL 10 μmol/L熒光底物，搖勻，55 ℃水浴加熱10 min，加入1.5 mL終止液（V（甲醇）∶V（正丁醇）∶V（蒸餾水）＝35∶30∶35）終止反應。酶標儀測定熒光強度，激發光和發射光波長分別為380 nm和450 nm。以每分鐘反應生成1 mmol 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量為1 個酶活力單位（U/g）。

1.3.4.2 Cat-L活力的測定

參考Barrett等[18-19]的方法略作改動。將Cat-L溶于蒸餾水中，取Cat-L溶液50 μL，依次加入900 μL乙二胺四乙酸-乙酸鈉緩沖液（4 mmol/L乙二胺四乙酸、0.4 mol/L乙酸鈉，pH 5.5，含20 mmol/L半胱氨酸和50 μL底物（10 μmol/L Z-Phe-Arg-MCA）），搖勻，55 ℃水浴加熱30 min，加入3.0 mL 0.1 mol/L氯乙酸鈉-乙酸緩沖液（pH 4.5）終止反應。酶標儀測定熒光強度，激發光和發射光波長分別為370 nm和460 nm。以每分鐘反應生成1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量為1 個酶活力單位（U/g）。

1.3.5 MBSP、Cat-L最適反應溫度的測定

參考1.3.4節的方法測定酶活力。反應溫度分別設置為25、35、45、55、65、75、85 ℃，測定不同溫度下MBSP、Cat-L活力，確定輻照對MBSP、Cat-L最適溫度的影響。

1.3.6 圓二色光譜測定MBSP、Cat-L的二級結構

參照Lee等[20]的方法略作修改。分別配制0.02 mg/L M B S P、C a t-L溶液，以蒸餾水為空白對照，在190～250 nm波長范圍進行光譜掃描，選用1 mm比色皿，測定溫度25 ℃，掃描速率50 nm/min，響應時間0.25 s，每組樣品重復掃描3 次，累加得到圓二色光譜圖，圖譜經過儀器本底消除和溶液空白差減。利用儀器自帶軟件分析MBSP、Cat-L各二級結構單元的相對含量。

1.4 數據統計與分析

實驗設置3～6 個平行，數據用fs表示，采用Origin 9.0軟件作圖，采用SPSS 19.0軟件中的Duncan檢驗進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 輻照對魚糜MBSP、Cat-L活力的影響

圖1 電子束輻照對魚糜MBSP和Cat-L活力的影響Fig.1 Effect of electron beam irradiation on the activity of MBSP and Cat-L from surimi

如圖1所示，與對照組相比，輻照后MBSP活力顯著下降，為對照組的87.60%～82.64%，但輻照劑量對其影響不顯著。除1 kGy組Cat-L活力與對照組接近外，其余各劑量組Cat-L活力下降顯著，尤其是9 kGy組Cat-L活力只有對照組的52%。電子束輻照所產生的高能射線作用于食品組織中的水而產生—H、—OH等活性自由基，從而使蛋白質等大分子物質發生斷裂、交聯等現象，改變蛋白質的表面疏水性、羰基及巰基含量，影響其生化特性。顧可飛[21]研究了電子束輻照對液態多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的影響，他認為PPO活力隨輻照劑量的增加而降低，在輻照劑量為4.83 kGy和8.69 kGy時，PPO活力分別下降了53%和85%，輻照在一定程度上抑制了PPO活力。馬艷萍等[22]利用60Co-γ射線輻照鮮食核桃，發現0.5 kGy輻照能明顯提高核桃冷藏期超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活力，抑制過氧化物酶、脂肪氧合酶活力?？梢?，輻照對酶活力的影響與輻照劑量及酶的種類有關。MBSP和Cat-L屬于蛋白質，輻照導致其活力降低與其結構變化有關。

2.2 輻照對魚糜MBSP、Cat-L最適溫度的影響

圖2 輻照劑量和反應溫度對魚糜MBSP活力的影響Fig.2 Effect of irradiation doses and reaction temperatures on the activity of MBSP from surimi

圖3 輻照劑量和反應溫度對魚糜Cat-L活力的影響Fig.3 Effect of irradiation doses and reaction temperatures on the activity of Cat-L from surimi

由圖2、3可知，隨溫度升高，MBSP和Cat-L活力均先升高后降低。各組魚糜MBSP的最適溫度均為55 ℃，對照組和1 kGy組魚糜Cat-L的最適溫度為55 ℃，5 kGy及7 kGy組Cat-L的最適溫度在45～55 ℃之間，但3 kGy及9 kGy輻照對Cat-L的最適溫度產生影響，使其由55 ℃降低至45 ℃。鮑曉瑾[23]、Cao Minjie[13]等分別發現鳙魚和狗母魚MBSP的最適溫度均為50 ℃；胡亞芹等[24]發現南藍鱈魚糜Cat-L的最適溫度為45 ℃；從海參體表純化到的Cat-L的最適溫度為50～60 ℃[25]。本研究中2 種酶的最適溫度與上述結果接近，電子束輻照沒有改變帶魚魚糜MBSP的最適溫度；隨劑量的增加，Cat-L的最適溫度略有降低，但均在容易引起魚糜凝膠劣化的溫度帶40～60 ℃范圍內，表明MBSP和Cat-L均有潛在的引起凝膠劣化能力。揭珍等[5]研究了溫度對帶魚魚糜肌原纖維蛋白的降解作用，認為在50～75 ℃時肌原纖維蛋白重鏈被降解，70 ℃時溶解肽含量達最高值，也和本研究MBSP和Cat-L在65～75 ℃時仍有較高活力的結果一致。

2.3 輻照對魚糜MBSP、Cat-L降解肌原纖維蛋白作用的影響

圖4 輻照對MBSP降解肌原纖維蛋白作用的影響Fig.4 Effect of irradiation on the myof i brillar protein degradation of MBSP

圖5 輻照對Cat-L降解肌原纖維蛋白作用的影響Fig.5 Effect of irradiation on the myof i brillar protein degradation ability of Cat-L

MBSP和Cat-L能有效降解肌原纖維中的MHC，而MHC的降解被認為是導致凝膠劣化的主要因素。分別用各組魚糜中提取的MBSP、Cat-L作用于肌原纖維蛋白，進一步利用SDS-PAGE進行分離，結果見圖4、5。圖5中對照組和1 kGy組中未見MHC條帶，但隨著輻照劑量的增加，圖4、5中的MHC條帶灰度明顯增加，尤其是9 kGy組，說明輻照減弱了魚糜MBSP和Cat-L對肌原纖維蛋白的降解作用；且相對于MBSP，Cat-L活性受輻照的影響更大。Jaczynski等[10]的研究發現輻照劑量越高，MHC的條帶越淺；Lin Xianping等[8]認為隨著輻照劑量增加至7 kGy和9 kGy，帶魚魚糜MHC降解較為明顯。說明輻照既能直接引起魚糜肌原纖維蛋白的降解，同時又能削弱魚糜MBSP和Cat-L對肌原纖維蛋白的降解，選擇合適的輻照劑量可以減輕肌原纖維蛋白被降解的程度，以促進魚糜形成凝膠。

2.4 輻照對MBSP、Cat-L二級結構的影響

蛋白質的二級結構是多肽鏈借助氫鍵進行盤旋或折疊而形成的周期性有規律的構象，主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲4 種構象單元?；诘鞍踪|不同類型構象單元吸光度的不同，圓二色光譜被廣泛應用于蛋白二級結構的測定。對照組和各輻照組魚糜MBSP、Cat-L的圓二色光譜圖如圖6、7所示。

圖6 MBSP的圓二色光譜圖Fig.6 Circular dichroism spectra of MBSP

圖7 Cat-L的圓二色光譜圖Fig.7 Circular dichroism spectra of Cat-L

圖8 MBSP的二級結構相對含量Fig.8 Relative contents of secondary structures in MBSP

圖9 Cat-L的二級結構相對含量Fig.9 Relative contents of secondary structures in Cat-L

由圖8可知，輻照后魚糜MBSP分子中的α-螺旋和無規卷曲的相對含量下降，β-折疊相對含量增加，β-轉角相對含量除5 kGy組外變化不明顯；隨著輻照劑量的增加，MBSP分子中α-螺旋相對含量先減少后增加，β-折疊相對含量的變化則相反，至5 kGy時α-螺旋相對含量最?。?1.00%），而β-折疊相對含量最大（21.70%）。由圖9可知，隨著輻照劑量的增加，Cat-L分子中α-螺旋相對含量的變化趨勢與MBSP一致，5 kGy時α-螺旋相對含量最?。?6.90%），β-折疊和β-轉角相對含量的變化沒有明顯規律，而無規卷曲的相對含量除9 kGy組外其余均略有上升。

總體上，低劑量輻照（不超過5 kGy）可以促使兩種酶中的α-螺旋結構向其他結構轉化，而輻照劑量增加至7 kGy時α-螺旋相對含量又有回升。維持酶蛋白二級結構的作用力主要為氫鍵，電子束輻照會引起氫鍵斷裂又重新形成，使二級結構的構象單元不斷互相轉變，而構象單元的變化引起空間結構的改變，最終影響其催化活性。吳燁[26]用圓二色光譜測定兔肌球蛋白的二級結構，發現在加熱過程中α-螺旋轉變成β-折疊和無規卷曲；Malik等[27]的研究發現輻照作用于向日葵蛋白，引起α-螺旋含量降低和β-折疊含量增加；顧可飛[21]的研究表明在輻照劑量低于4.83 kGy時，PPO α-螺旋、β-折疊和β-轉角相對含量變化不大，當輻照劑量超過4.83 kGy時，隨著劑量的增加，α-螺旋、β-折疊和β-轉角含量不斷下降，而無規卷曲含量上升；鄧思瑤等[9]發現與未輻照魚糜相比，5 kGy輻照后魚糜蛋白α-螺旋含量下降，β-折疊和無規卷曲含量上升，而β-轉角含量無明顯變化，輻照處理使肌原纖維蛋白分子間氫鍵及分子間相互作用逐漸減弱；Herrero等[28]利用拉曼光譜研究了0～8 kGy電子束對鮭魚魚肉蛋白質二級結構的影響，發現8 kGy組魚肉蛋白的二級結構發生明顯改變，其中α-螺旋比例顯著下降，β-折疊、β-轉角和無規卷曲比例增加；Lee等[20]采用圓二色光譜法分析γ射線對肌紅蛋白分子特性的影響，研究表明隨輻照劑量的升高，肌紅蛋白α-螺旋含量降低的同時無規卷曲含量升高；Moon等[29]采用圓二色光譜研究發現隨著輻射時間的延長或強度的增加，蛋白質有序結構的破壞更加明顯；Guan Aiyan等[30]發現電子束輻照使中華管鞭蝦原肌球蛋白分子中的α-螺旋含量減少，而β-折疊和無規卷曲含量增加，導致其免疫原性的下降?？梢?，輻照對大多數蛋白來說會破壞其有序的構象單元，改變其構象單元的相對含量。本實驗中，當輻照劑量在5 kGy及以下時，魚糜MBSP和Cat-L分子中穩定的α-螺旋結構相對含量下降的同時，無規卷曲相對含量變化較小，而β-折疊相對含量升高?？梢娸椪諏Φ鞍锥壗Y構的影響與劑量及蛋白種類有關，二級結構的改變會影響其生物學功能。

3 結 論

電子束輻照處理引起帶魚魚糜內源性MBSP、Cat-L二級結構的變化，輻照后魚糜MBSP、Cat-L分子中的α-螺旋相對含量下降，從而影響其空間結構和穩定性，導致MBSP和Cat-L活力降低，并一定程度上降低了MBSP和Cat-L對帶魚魚糜肌原纖維蛋白的降解；電子束輻照沒有改變帶魚魚糜MBSP的最適溫度，3 kGy及9 kGy輻照后魚糜Cat-L的最適溫度略有降低，但各組MBSP和Cat-L的最適溫度均在引起凝膠劣化的溫度帶（40～60 ℃）范圍內，而且在高溫下仍有較高活力，因此在熱誘導魚糜凝膠形成過程中仍應避開這一溫度帶，以免引起凝膠劣化。