異丙酚上調miR-21表達改善大鼠缺血/再灌注損傷學習記憶的機制

豐 亮,曹 蘇

(1.南通市第二人民醫院 麻醉科，江蘇 南通 226002；2.南通大學附屬醫院 麻醉手術科，江蘇 南通 226001)

異丙酚(propofol)是一種快速有效的全身麻醉劑，具有起效快、麻醉時間短、副作用小等臨床特點，常被用于各科麻醉和重癥病人的鎮靜。異丙酚對缺血再灌注損傷具有一定的保護作用，如在小腸、肝臟、腎臟、心肌等[1-4]。異丙酚對腦組織缺血再灌注損傷也有保護作用[5-6]。有研究報道異丙酚可能激活細胞存活信號通路磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)，阻止海馬錐體細胞死亡而發揮保護腦缺血再灌注的損傷[7]。然而異丙酚調控下游的信號通路及保護機制尚不清楚。微小RNA-21(miR-21)是一種研究較早的miRNA。miR-21的研究主要集中在調控腫瘤細胞的生物活性[8-9]。已有的報道指出大腦缺血再灌注損傷可能下調miR-21的水平促進神經細胞的死亡[10]。本研究主要解答異丙酚是否通過影響miR-21而發揮保護腦缺血再灌注損傷，并從細胞自噬的角度研究相關的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 Morris水迷宮(XR-XM101，上海欣軟生物)，激光共聚焦顯微鏡(FV1000，OLYMPUS，日本)，Beclin1抗體(CST，美國)，LC3B抗體(CST，美國)，miR-21類似物(上海吉瑪，中國)，異丙酚(批號：040607015，Fresenius Kabi公司，德國)。

1.2 大鼠大腦中動脈栓塞(MCAO)模型 清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只(體質量200～250 g)購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。自然光照，動物自由進食、飲水，室溫控制在(22±2)℃。通過10%的水合氯醛(4 mL/kg)麻醉后局部消毒備皮，沿頸部正中切口2～2.5 cm，然后分離頸總動脈，沿左側頸總動脈分離頸外、頸內動脈，結扎并游離頸外、頸內動脈近心端。沿切口插入直徑為0.3 mm尼龍線，將尼龍線輕輕插入頸內動脈，120 min后拔出。假手術組大鼠僅暴露、分離結扎血管。

1.3 實驗動物及分組 實驗分為4組(n=8)，分別為假手術組、模型組、異丙酚處理組、miR-21類似物組。異丙酚組為缺血后異丙酚治療組，線栓阻斷動脈血流成功后尾靜脈滴注50 mg/(kg·h)(30 min)異丙酚；miR-21類似物組為線栓阻斷動脈血流成功后經腹腔注射200 μL miR-21類似物，2 h后恢復大腦中動脈的血流。造模7 d后進行行為學、分子生化等實驗。

1.4 Morris水迷宮 共經歷時4 d學習，訓練開始時，將平臺置于第二象限。自由錄像記錄系統記錄大鼠找到平臺的時間(escape latency)，4次訓練將大鼠分別從四個不同的起始點(不同象限)放入水中。大鼠找到平臺后或60 s內找不到平臺(潛伏期記為60 s)，則由實驗者將其拿上平臺，在平臺上休息15 s，再進行下一次實驗。第5天進行空間探索實驗，撤除原平臺，將大鼠任一個入水點記錄大鼠1 min在平臺所在象限停留的時間。

1.5 熒光定量PCR 收集損傷側海馬組織，提取RNA后根據逆轉錄試劑盒合成cDNA，以cDNA為模板，在熒光定量PCR儀上進行檢測，以U6為內參，算出各組miR-21的相對表達量。引物序列如下。miR-21：Forward 5′-TGTACCACCTTGTCGG-3′，Reverse 5′-TGCTGTTGCCATGAGAT-3′；U6：Forward 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′；Reverse 5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′。

1.6 免疫印跡 將海馬組織置于2 mL勻漿器中，加400 μL單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中勻漿，然后置于冰上，裂解海馬組織。將裂解液移至1.5 mL離心管，然后在4 ℃下12 000 r/min離心5 min，取上清分裝于0.5 mL離心管中并置于-20 ℃保存。將樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，以55 V恒壓電泳，使樣品壓縮至濃縮膠與分離膠界面，改電壓為110 V繼續電泳。在200 mA條件下轉膜150 min；5%脫脂奶粉室溫搖床震蕩封閉3 h；一抗(1∶1000)置于搖床4 ℃孵育過夜；二抗(1∶5000)室溫搖床震蕩孵育2 h。ECL顯色試劑顯色，Fluor Chem FC3化學發光成像系統曝光；Image J軟件分析。

1.7 免疫熒光 大鼠海馬組織經4% PFA固定24 h后，再經30%蔗糖脫水，冰凍切片，PBS潤洗，10%山羊血清室溫封閉1 h，加入相應濃度一抗4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，二抗室溫避光孵育2 h后，加DAPI孵育10 min，PBS避光清洗3次，貼片，晾干加封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下攝片，計算平均熒光強度(MFI)。

1.8 統計學分析 應用GraphPad Prism 6.0統計學軟件進行統計分析，數據符合正態分布的應用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差和重復測量的方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異丙酚處理提高缺血/再灌注損傷模型miR-21、Beclin 1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達 結果顯示，模型組miR-21的表達低于假手術組(P<0.05)，而異丙酚組和miR-21類似物組miR-21的表達高于模型組(P<0.05)；模型組Beclin 1/β-actin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1 MFI高于假手術組(P<0.05)，而異丙酚組和miR-21類似物組Beclin 1/β-actin、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin 1 MFI低于模型組(P<0.05)。見表1，圖1、2。

組別miR-21Beclin 1/β-actinLC3-Ⅱ/LC3-ⅠBeclin 1 MFI假手術組1.00±0.040.29±0.100.22±0.081.00±0.00模型組0.45±0.13*0.62±0.07*0.41±0.06*1.40±0.15*異丙酚組1.11±0.15#0.29±0.09#0.24±0.04#1.02±0.06#miR-21類似物組1.20±0.12#0.34±0.15#0.25±0.09#1.01±0.10#F65.50217.65312.45333.765P0.000.000.000.00

注：和假手術組比較，*P<0.05；和模型組比較，#P<0.05。MFI：平均熒光強度。

2.2 異丙酚處理改善缺血/再灌注模型學習記憶 結果顯示，尋找平臺潛伏期各組有隨著時間下降的趨勢(P<0.05)，假手術組和miR-21類似物組尋找平臺潛伏期第2天、第3天、第4天較對應組前一天均下降(P<0.05)；模型組和異丙酚組第3天、第4天較第1天、第2天下降(P<0.05)。訓練前3天各組間沒有差異(P>0.05)，訓練第4天模型組、異丙酚組與假手術組間有差異(P<0.05)，miR-21類似物組和模型組有差異(P<0.05)，見表2、3。第5天的記憶測試結果顯示，模型組、異丙酚組和miR-21類似物組停留在平臺象限的時間較假手術組減少(P<0.05)；和模型組比較，異丙酚、miR-21類似物處理能提升平臺象限停留時間(P<0.05)，詳見表4。

組別尋找平臺潛伏期/s第1天第2天第3天第4天假手術組55.32±5.9944.52±5.99a30.12±4.07ab16.92±4.60abc模型組54.94±3.5847.98±3.6137.82±7.01ab34.72±10.46ab*異丙酚組58.10±2.5052.60±8.6934.72±6.20ab29.08±11.86ab*miR-21類似物組58.40±2.6345.42±6.29a33.28±7.07ab24.18±9.26abc#

注：和假手術組比較，*P<0.05；和模型組比較，#P<0.05。和第1天比較，aP<0.05；和第2天比較，bP<0.05；和第3天比較，cP<0.05。

表3 重復測量的方差分析結果

ANOVA tableSSDFMSFP時間16 605.0035535.002005.000.00組別526.903175.6038.400.00時間×組別801.80989.0823.630.00

組別目標象限停留時間/s假手術26.40±4.83模型組9.60±2.79*異丙酚組20.40±1.95*#miR-21類似物組17.80±2.39*#F38.26P0.00

注：和假手術組比較，*P<0.05；和模型組比較，#P<0.05。

3 討論

本研究結果提示在缺血后給予異丙酚能夠改善再灌注引起的學習記憶下降。研究首次報道了MCAO模型海馬組織miR-21的表達水平下降，而異丙酚能夠逆轉miR-21水平下降。然而，異丙酚也被報道具有一定的神經毒性，主要體現在影響神經發育[11]或者影響神經干細胞的轉化[12]。因此，本研究認為控制異丙酚的劑量可能是一種重要的保護成年缺血再灌注損傷的策略。

1，2，3，4分別是假手術、模型、異丙酚和miR-21類似物組。

圖1 異丙酚處理降低中動脈缺血/再灌注引起的細胞自噬死亡相關蛋白的表達

A.假手術組；B.模型組；C.異丙酚組；D.miR-21類似物組。

圖2 異丙酚處理降低中動脈缺血/再灌注引起的Beclin1的表達

實驗中，模型組訓練逃避潛伏期較假手術組沒有明顯的影響，而在平臺停留期時間縮短，指出記憶功能的下降。本研究發現異丙酚能夠降低MCAO引起的記憶下降。缺血再灌注的損傷主要體現在再灌注的沖擊。缺血過程在整個過程可能起著一定的保護作用，但不足以逆轉再灌注的損傷；而在缺血過程，給予異丙酚能夠加強這種保護作用。研究發現miR-21在模型組表達下降，在缺血階段使用miR-21類似物也能抑制再灌注造成的損傷。

腦缺血再灌注損傷能引起神經細胞自噬性死亡[13]。本研究檢測細胞自噬相關的經典蛋白Beclin1和LC3的表達，通過免疫印跡和免疫熒光技術發現MCAO能促進細胞自噬性死亡，而異丙酚處理降低自噬性死亡相關蛋白的表達。與此同時，miR-21類似物也能降低MCAO造模引起的自噬性死亡蛋白的表達。盡管預缺血能夠引起細胞自噬，而且自噬在缺血再灌注損傷中扮演著保護的角色，適度和過度的自噬對于神經功能的作用是相反的。前期的研究報道了異丙酚通過抑制PTEN發揮保護腦缺血再灌注的損傷。而且，miR-21可能通過調控PTEN/AKT/mTor通路影響細胞自噬[14]。本研究提示該過程或信號通路在腦缺血再灌注損傷過程發揮相似的作用。異丙酚通過上調miR-21從而阻止缺血再灌注模型海馬細胞的程序化死亡和學習記憶下降。